Biosynthesis of Vitamin B2 (Riboflavin) : Studies on the Reaction Mechanism of Riboflavin Synthase.

Abstract

Riboflavinsynthase katalysiert die Übertragung eines Vierkohlenstofffragmentes zwischen zwei 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinmolekülen. Dabei entstehen ein Riboflavinmolekül und ein 5-Amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)pyrimidindionmolekül. Wie früher berichtet wurde, entsteht dabei als Reaktionsintermediat ein pentazyklisches Addukt aus zwei Lumazinmolekülen, welches durch Riboflavinsynthase teil zu Riboflavin, teil zu Pyrimidindion umgewandelt wird. Das pentazyklische Addukt wurde vor zehn Jahren entdeckt. Trotzdem blieb die Reaktionssequenz, die zu seiner Bildung führen kann, eher problematisch. In dieser Studie wurde nachgewiesen, dass die rekombinante N-terminale Domäne der Riboflavinsynthase aus Escherichia coli das Exomethylenanion, aber keines der trizyklischen Addukten von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin binden kann, obwohl die letzteren das Aniongleichgewicht in wässrigen Lösungen von Lumazin dominieren. Basiert auf dieser Erkenntnis wird eine neue hypothetische Reaktionssequenz für Riboflavinsynthase vorgeschlagen. Diese fängt mit der Übertragung eines Hydridions von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinexomethylenanion auf elektroneutrales 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazinmolekül an. Das dadurch entstandene Molekülpaar, Dehydrolumazin und Dihydrolumazin, gehen in eine 4 + 2 Zykloaddition ein das zu einem experimentell nachgewiesenen pentazyklischen Reaktionsntermediat führen kann. Im Unterschied zu den früheren Hypothesen über den Reaktionsablauf braucht der vorgeschlagene Reaktionsmechanismus die Beteiligung eines Nukleophils nicht. Übrigens, die Hypothese über Existenz eines solchen Nukleophils fand trotz zahlreicher Daten über räumlicher Struktur des Enzyms noch keine Unterstützung. Das neue Konzept braucht eine solche Anforderung nicht, ist wesentlich einfacher und steht in Einklang mit allen vorhandenen experimentellen Daten.

Riboflavin synthase catalyzes the transfer of a 4-carbon fragment between two molecules of the substrate, 6,7-dimethyl-8-ribityl¬lumazine, resulting in the formation of riboflavin and 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidinedione. Earlier, a pentacyclic adduct formed from two substrate molecules was shown to be a catalytically competent intermediate, but the mechanism of its formation is still poorly understood. The present study shows that the recombinant N-terminal domain of riboflavin synthase from Escherichia coli interacts specifically with the exomethylene-type anion of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine but not with any of the tricyclic adduct-type anions that dominate the complex anion equilibrium in aqueous solution. Whereas these findings can go along with previously published mechanistic hypotheses, we also present a novel, hypothetical reaction sequence that starts with the transfer of a hydride ion from the 6,7-dimethyl-8-ribityl¬lumazine exomethylene anion to an electroneutral 6,7-dimethyl-8-ribityl¬lumazine molecule. The pair of dehydrolumazine and dihydrolumazine molecules resulting from this hydride transfer is proposed to undergo a 4+2 cycloaddition affording the experimentally documented pentacyclic intermediate. In contrast to earlier mechanistic concepts requiring the participation of a nucleophilic agent, which is not supported by structural and mutagenesis data, the novel concept has no such requirement. Moreover, it requires fewer reaction steps and is consistent with all experimental data.