Tracing carbon fluxes within two distinct microbial communities in anaerobically methane oxidising mats by stable isotope probing

Abstract

Methan ist ein bedeutendes Treibhausgas und beeinträchtigt das globale Klima. Die Konzentration in der Atmosphäre hat sich seit Beginn der Industrialisierung mehr als verdoppelt. Neben anthropogenen gibt es auch bedeutende natürliche Quellen. So werden beispielsweise in anoxischen marinen Sedimenten große Mengen an Methan gebildet, von denen jedoch nur ein kleiner Teil in die Wassersäule und die Atmosphäre emittiert wird. Jedoch vermindert die anaerobe Oxidation von Methan (AOM) bis zu 85% der Methanemission aus den marinen Sedimenten. Dieser Prozess ist damit im globalen Methankreislauf von erheblicher Bedeutung, da er letztlich die Methankonzentration in der Atmosphäre mit reguliert (del Giorgio und Duarte, 2002; Reeburgh, 2007). Obwohl bereits Ende der siebziger Jahre durch Reeburgh (1976) sowie Barnes und Goldberg (1976) aufgrund von Porenwasserprofilen dieser Prozess als wahrscheinlich beschrieben wurde, gelang es erst 1999 Hinrichs et al., gefolgt von Boetius et al. (2000) entsprechende Euryarchaeota zu identifizieren und direkt mit biogener anaerober Methanoxidation in Verbindung zu setzen. Die identifizierten Archaeen werden in drei Gruppen aufgeteilt, ANME-1, -2 und -3 (ANaerobe MEthanotrophe Archaeen), die wiederum unterschiedliche Subgruppen enthalten. Diese methanotrophen Archaeen sind nah verwandt mit verschiedenen methanogenen Ordnungen, den Methanomicrobiales, Methanosarcinales und Methanococcales (Hinrichs et al., 1999; Boetius et al., 2000; Knittel et al., 2005). Wenngleich jüngst auch AOM unter Verwendung anderer Elektronenakzeptoren nachgewiesen wurde, so ist in marinen Sedimenten der Prozess der AOM mit an sulfatreduzierende Bakterien (SRB) gekoppelt. Deshalb wird er auch als sulfatabhängige AOM beschrieben. Unter Standardbedingungen liefert die sulfatabhängige AOM nur sehr wenig Energie, ΔG0 = -22,8 kJ/mol (Barnes und Goldberg, 1976). Viele physiologische Details der AOM sind immer noch ungeklärt. Heute wird die sulfatabhängige AOM als reverser Prozess der Methanogenese betrachtet. Dies ist gestützt durch die Entdeckung eines neuen nickelbindenden Coenzyms F430 in ANME-1 und genomanalytische Untersuchungen von Umweltproben (Krüger et al., 2003; Hallam et al., 2004; Meyerdierks et al., 2005, 2010; Shima et al., 2011). Bisher sind noch keine Isolate kultiviert worden, weder der ANME-1, -2 oder -3, noch der assoziierten sulfatreduzierenden δ-Proteobakterien. Neben ANME und SRB zeigten jüngere molekularbiologische Untersuchungen interessanterweise eine hohe mikrobielle Diversität an entsprechenden AOM Standorten. Jedoch blieben der Metabolismus und die Funktionsweise dieser Gemeinschaften immer noch ungeklärt. Frühere Studien demonstrierten ein methanogenes Potential mit unterschiedlichen Substraten (Seifert et al., 2006; Treude et al., 2007; Orcutt et al., 2008). Eine Möglichkeit um Kohlenstoffflüsse in mikrobiellen Matten zu untersuchen, ist die Inkubation mit isotopisch markierten Substraten, sogenanntes (englisch) Stable Isotope Probing (SIP; Boschker et al., 1998). Neben der so erlaubten Verfolgung des Substratkohlenstoffs in die Gesamtbiomasse, können auch verschiedene organismenspezifische Lipidbiomarkermoleküle verwendet werden, die einen Einblick in die physiologische Strategie der Mitglieder dieser mikrobiellen Gemeinschaft ermöglichen. In dieser Arbeit wurden vorherige Markierungsstudien (Methan, Bikarbonat; Blumenberg et al., 2005; Wegener et al., 2008a; Jagersma et al., 2009) um bislang nicht untersuchte 13C-angereicherte Substrate (Acetat, Methanol) erweitert, um AOM abhängige und methanunabhängige Stoffwechsel zu untersuchen. Dazu wurden zwei AOM-basierte mikrobielle Lebensgemeinschaften aus dem Schwarzen Meer untersucht. Hierbei handelte es sich um ANME-1 oder ANME-2 dominierte Gemeinschaften (Michaelis et al., 2002; Blumenberg et al., 2004), so dass beide Vergesellschaftungen erstmals getrennt diesbezüglich analysiert werden konnten. Begleitend wurden die Raten des Methankonsums, der Methanbildung und der Sulfatreduktion bestimmt, um die Aktivitäten der jeweiligen untersuchten ANME-Archaeen und der entsprechenden sulfatreduzierenden Bakterien zu verfolgen. Die Methan- und Bikarbonatansätze ähneln dabei den entsprechenden in-situ Bedingungen. Mit Acetat wurden heterotrophe Eigenschaften der gesamten Gemeinschaft untersucht. Während der Inkubationen mit Methanol sollten methylotrophe Eigenschaften der Archaeen, sowie potentielle homoacetogene Stoffwechsel untersucht werden. Mit Hilfe, der in dieser Arbeit eingesetzten 13C-Markierungsexperimente, sollten neue Einsichten in die komplexen physiologischen Prozesse innerhalb der mikrobiellen AOM-Gemeinschaften gewonnen werden.

Methane is a significant greenhouse gas that affects the global climate. The concentration in the atmosphere has more than doubled since the beginning of the industrialisation. Along with anthropogenic sources, there are also natural sources. For instance, high amounts of methane are formed in the anoxic marine sediments. However, only a minute part rises up into the water column and the atmosphere. The process of the anaerobic oxidation of methane (AOM) reduces its net emission from the sediments to the water body and atmosphere by more than 85 % and is therefore an important process in controlling the atmospheric concentration (del Giorgio and Duarte, 2002; Reeburgh, 2007). Although AOM was described by Reeburgh (1976) as well as Barnes and Goldberg (1976) in the late seventies as a possible process, due to pore water profiles, it was not until 1999 that Hinrichs et al. followed by Boetius et al. (2000) connected euryarchaea with biogenic oxidation of methane under anoxic conditions. In the meantime, the identified clusters could be divided into three groups; ANME-1, -2 and -3 (ANaerobic MEthanotrophic archaea) with different subgroups. These methanotrophicarchaea are closely affiliated to different methanogenic orders, Methanomicrobiales,Methanosarcinales and Methanococcales (Hinrichs et al., 1999; Boetius et al., 2000; Knittel et al., 2005). Although, recently AOM was also proven to belinked to other electron acceptors, the process of AOM in marine sediments is linkedwith sulphate reducing bacteria (SRB). Thus it is also considered as sulphatedependent AOM. It is a very low energy yielding process under standard conditions, ΔG0 = -22.8 kJ/mol (Barnes and Goldberg; 1976). Many physiological details of AOM are still unclear. Today the sulphate-related AOM is considered as a reverse process of the methanogenesis. This was supported by the finding of a new nickel binding coenzyme F430 in ANME-1, and genomic analysis of environmental samples (Krüger et al., 2003; Hallam et al., 2004; Meyerdierks et al., 2005, 2010; Shima et al., 2011). There are still no isolated pure cultures from the ANME-1, -2, -3 or the involved sulphate reducing δ-proteobacteria. Interestingly, recent molecular biological investigations revealed that along with ANME-archaea and SRB, there exists a high microbial diversity in AOM-settings. However, the metabolisms and the function in those communities still remain unclear. Previous studies have already demonstrated methanogenic capabilities with different substrates (Seifert et al., 2006; Treude et al., 2007; Orcutt et al., 2008). One approach to investigate the carbon fluxes in a microbial mat is an incubation technique with stable isotope labelled substrates – Stable Isotope Probing (Boschker et al., 1998). Along with the enabled tracing of the carbon flow into the total biomass, several specific lipid biomarker molecules can also be used to gain information on the metabolic strategy of the prokaryotic members of such a microbial community. Within this work, previous labelling studies (methane, bicarbonate; Blumenberg et al., 2005; Wegener et al., 2008a; Jagersma et al., 2009) were extended with substrates which as of yet have not been investigated (acetate, methanol) to shed light on AOM-linked and other non-methane related metabolisms. Therefore, two different AOM-performing microbial mats from the Black Sea were investigated. These communities exhibit almost pure ANME-1 or ANME-2 dominated communities, respectively (Michaelis et al., 2002; Blumenberg et al., 2004), thus both communities were separated for the first time so that they could be analysed. Alongside this, the assimilation rates for 13C from the labelled substrates (methane, bicarbonate, acetate, methanol) into archaeal and bacterial lipids were traced. In addition the rates of methane consumption, methanogenesis and sulphate reduction were determined to outline the activities of the respective ANME-archaea and sulphate reducing bacteria. The experiments with methane and bicarbonate are similar to the respective in-situ conditions. The experiments with acetate investigated the heterotrophic capabilitiesof the whole prokaryotic community. During the incubations with methanol, the methylotrophic capabilities of the archaea and potential homoacetogenic physiologies should be determined. With the help of the conducted 13C-labelling experiments during this work, new insights into the complex physiological processes within the microbial AOM-communities should be achieved.