Stimulation of Homologous Recombination by P53 gain-of-function mutant M237I

Abstract

Lung cancer is the number one killer of cancers in women and men in the western world. 85% of lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC). A549 and H1299 are NSCLC cell lines. The worldwide distributions of cancers and the percentage of them containing p53 mutants differ between cancer types. About 50% of NSCLC tumors contain p53 mutations.

Homologous recombination (HR) is an important repair mechanism for DNA doublestrand-breaks. Inappropriate and elevated levels of HR can lead to genomic instability which may promote cancer development.

P53 is a protein involved in cell cycle arrest, senescence, apoptosis, differentiation and DNA repair. P53 is the most commonly mutated tumor suppressor gene. A correlation between missing or mutated p53 and the development of cancer is known as well as a correlation between the overexpression of p53-mutants and the bad prognosis of cancer patients.

P53 is known for its direct interactions with components of the HR such as Rad51. Wildtype p53 downregulates the HR, its transcription factor activity not being essential for this inhibition. P53 is the most commonly mutated tumor suppressor protein. Some p53 mutants (e.g. 273L) have lost the ability to downregulate the HR, but not all of them: Cells containing the p53 mutant M237I showed an increased recombination activity and increased spontaneous and x-ray induced mutation frequencies in comparison to wt p53 cells.

We reproduced the suppression of HR by P53QS in comparison to p53-null H1299 cells and concluded the transcription factor activity not being essential for the suppression of the HR activity. The p53M237I mutant expressing cells showed higher HR activity levels than p53-null and p53QS expressing cells. The increased HR activity was seen in p53M237I pooled population cells as well as in single clone derived cells: Results are compatible with p53 mutant M237I being a gain-of-function mutant.

In p53M237I cells we additionally saw more DSBs marked by 53BP1 than in p53-null and p53QS cells and concluded the HR activity could be due to more DNA DSBs. All three H1299 cell lines (H1299FRT/p53QS, H1299FRTzeo and H1299FRT/p53M237I) showed RPA foci after the treatment with thymidine (5mM, 24h).

We propose the protein p53 taking part in the replication fork stabilization similar to the protein ATR. There is evidence that p53 is part of the ATR-checkpoint.

Lungenkrebs ist die häuptsächliche Todesursache unter den Krebserkrankungen bei Frauen und Männern in der westlichen Welt. 85% der Lungentumoren sind Nicht-Kleinzellige Bronchialkarzinome (NSCLC). A549 und H1299 sind NSCLC Zelllinien. Die weltweite Verteilung von Krebserkrankungen und der Prozentsatz der Tumoren, die P53 Mutanten exprimieren, unterscheiden sich zwischen den Krebserkrankungen. Ungefähr 50% der NSCLC enthalten P53 Mutationen.

Homologe Rekombination (HR) ist ein wichtiger DNA-Doppelstrangbruch Reparaturmechanismus. Unangemessene und erhöhte Level an HR können zu genomischer Instabilität führen, welche die Entwicklung von Krebserkrankungen fördert.

P53 ist ein Protein, welches in den Zellzyklusarrest, die Zellalterung, Apoptose, Zelldifferenzierung und DNA-Reparatur involviert ist. P53 ist das am häufigsten mutierte Tumorsuppressorgen. Sowohl die Korrelation zwischen fehlendem oder mutiertem P53 und der Entwicklung von Tumoren als auch die Korrelation zwischen der Überexpression von P53-Mutanten und der schlechten Prognose von Krebspatienten ist bekannt.

P53 ist für seine direkten Interaktionen mit Komponenten der HR wie z.B. Rad51 bekannt. Wildtyp-P53 vermindert die HR Aktivität, wobei die Transkriptionsfaktor Aktivität für die Unterdrückung nicht wesentlich ist.

P53 ist das am meisten mutierte Tumorsuppressorprotein. Einige P53 Mutanten (z.B. 273L) haben die Fähigkeit zur Verminderung der HR Aktivität verloren, aber nicht alle Mutanten verhalten sich auf diese Weise: Zellen, welche die P53 Mutante M237I exprimieren zeigen eine erhöhte Rekombinationsaktivität und erhöhte spontane und Röntgen-induzierte Mutationsfrequenzen im Vergleich zu P53-Wildtyp Zellen.

Wir haben die Unterdrückung der HR durch die Transkriptionsfaktoraktivitäts geminderte P53-Mutante QS im Vergleich zu P53-null H1299 Zellen reproduziert und schlussfolgerten, dass die Transkriptionsfaktoraktivität nicht wesentlich für die Unterdrückung der HR Aktivität ist. P53 M237I exprimierende Zellen zeigten höhere HR Aktivitäten als P53-null und p53QS exprimierende Zellen. Die erhöhte HR Aktivität wurde sowohl in P53 M237I gepoolten Zellen, als auch in Zellen, die Klone einer einzelnen Zelle waren, gesehen. Die Ergebnisse sind vereinbar mit der Annahme, dass die P53 Mutante M237I eine gain-of-function Mutante ist.

In P53 M237I exprimierenden Zellen sahen wir zusätzlich mehr DNA Doppelstrangbrüche, welche durch 53BPI in P53-null und P53QS exprimierenden Zellen gemessen wurden. Wir schlussfolgerten, dass die HR Aktivität durch mehr DNA Doppelstrangbrüche verursacht sein könnte. Alle drei H1299 Zelllinien (H1299FRT/p53QS, H1299FRTzeo und H1299FRT/p53M237I) zeigten RPA Foci nach der Behandlung mit Thymidin (5mM, 24 Stunden).

Wir vermuten, dass das Protein P53 an der Stabilisierung der Replikationsgabel ähnlich wie das Protein ATR teilnimmt. Es gibt Hinweise darauf, dass P53 ein Teil des ATR-Checkpoint ist.