Untersuchungen zur Epidemiologie und zu funktionellen Resistenzmechanismen gramnegativer Bakterien gegenüber Benzalkoniumchlorid und Chlorhexidin

Abstract

Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass es in den vergangenen Jahren zu einer deutlichen Zunahme biocidresistenter Varianten gramnegativer Species insbesondere gegenüber Benzalkoniumchlorid gekommen ist. Durch Exposition gegenüber subletalen Konzentrationen konnte diese Resistenz bei E. coli und Enterobacter spp. unter Versuchsbedingungen innerhalb eines kurzen Zeitraumes künstlich erzeugt und deren Stabilität auch in wirkstofffreier Umgebung nachgewiesen werden. Ursächlich hierfür ist möglicherweise ein multifaktorielles Geschehen durch eine Veränderung der Membranstruktur, insbesondere der exprimierten Proteine der äußeren Membran. Diese Proteine formieren als triparter Komplex Efflux Systeme, welche bekannterweise bereits Antibiotikaresistenzen und auch Biocidresistenzen vermitteln. Vor dem Bild der epidemiologischen Ergebnisse ist davon auszugehen, dass bereits heute für einen Teil der Erreger auch die empfohlenen Anwendungskonzentrationen der handelsüblichen Biocide nicht ausreichend wirksam sind. Es gilt also, neue und innovative Strategien zu entwickeln. Neben bereits implementierten Maßnahmen, wie Surveillance-Systemen, zur Berücksichtigung lokaler Resistenzmuster im Fall von Antibiotikaresistenzen, sollten auch Additiva in Form von Effluxinhibitoren in das Armamentarium aufgenommen werden. Für Antibiotika ist der Zusatz von Inhibitoren, z. B. gegenüber Penicillinase, gängige Praxis. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine vergleichbare Strategie auch für biocidresistente gramnegative Erreger zum Erfolg führen könnte. Hierbei hat sich 1- (1-methylnaphtyl) -piperazin als potenter Wirkstoff erwiesen. Um eine sichere Anwendung im medizinischen Bereich bzw. am Menschen zu gewährleisten, sind weitere Untersuchungen notwendig. Solange bei fortschreitender Prävalenz der Biozidresistenz zuverlässige und klinisch anwendungsbereite Inhibitoren fehlen, liegt die Kernbedeutung der Kenntnis des Problems in einer verantwortungsbewussten, sorgfältigen und den jeweiligen Resistenzspektren angepassten Desinfektionsstrategie. Im Vordergrund steht dabei die Anwendung von Biociden in einer ausreichend hohen Konzentration und Einwirkdau-er. Wie auch bei zunehmender Antibiotikaresistenz mit Surveillance-Systemen den lokalen Gegebenheiten begegnet wurde, wäre eine Implementierung vergleichbarer Konzepte für die Desinfektion und Antiseptik wünschenswert.

List of Tables 5 List of figures 6 Abbreveations 7 1 Introduction 8 1.1 Chlorhexidingluconat 12 1.2 Benzalkoniumchlorid 14 1.3 Common features of Chlorhexidingluconat and Benzalkoniumchlorid 15 1.4 Resistance 15 2 Purpose 19 3 Material and methods 20 3.1 Bacteria 20 3.1.1 Screening 20 3.1.2 Induction of resistance 20 3.1.3 Inhibition / SDS-Gelelectrophoresis 21 3.2 Growth media 21 3.2.1 Agar 21 3.2.2 Müller-Hinton-Bouillon (MHB) 21 3.3 Chemicals and Buffer solutions 21 3.3.1 Benzalkoniumchloride 21 3.3.2 Chlorhexidine 22 3.3.5 E-Test with Cefoxitin/Cefuroxim 22 3.3.6 Phenylarginin-ß-Naphtylamide 22 3.3.7 1- (1-Naphthylmethyl) -piperazine 23 3.3.3 Protein assay (Markwell) 23 3.3.4 2-%-SDS-Gelelektrophoresis 24 3.4. Apparatuses 25 4 Methods 26 4.1 Suspension and growth conditions 26 4.1.1 Cultivation for screening 26 4.1.2 Cultivation for induction of resistance 26 4.1.3 Growth controll 27 4.1.4 Persistance of induced resistance 28 4.1.5 Cross-resistance between BKC and CHX 28 4.1.6 Determination of metabolic processes with BBL-Enterotube® 28 4.1.7 Inhibition 28 4.2 Characterising of the isolates 30 4.2.1 Identification of metabolic features 30 4.2.2 Identification of antibiotic cross-resistance 31 4.3 Storage 31 4.4 Protein assay (Markwell) 31 4.4.1 Outer membrane isolation 31 4.4.2 Proteincontent 32 4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresis 33 4.7 MALDI/Tandem-Mass-Spectrometry 34 5 Results 35 5.1 Screening for biocidresistant isolates 35 5.1.1 Screening with TSA-Agar 35 5.1.2 Screeninguntersuchung with Iso-Sensitest-Agar 36 5.2 Influence of growth media on resistance testing 36 5.2.1 Comparative study with BKC 36 5.2.2 Comparative study with CHX 37 5.3 Differentiation of resistant isolates 38 5.3.1 Growth on benzalkoniumchloride (300 µg/ml) 38 5.3.2 Growth on benzalkoniumchloride (500 µg/ml) 38 5.3.3 Growth on Chlorhexidine (300 µg/ml) 39 5.4 Development of resistance from 1994 to 2005 40 5.5 Induction of resistance 41 5.5.1 Induction of chlorhexidinresistant E. coli 41 5.5.2 Induction of chlorhexidinresistant Enterobacter spp. 41 5.5.3 Induction of benzalkoniumchloridresistant E. coli 44 5.5.4 Induction of benzalkoniumchloridresistant Enterobacter spp. 46 5.6 Stability of resistance 48 5.7 Cross resistance between BKC and CHX 49 5.8 Antibiotic cross resistance / E-Test 51 5.8.1 Antibiotic susceptibility testing of benzalkoniumchloridresistant isolates 51 5.8.2 Antibiotic susceptibility testing of chlorhexidinresistant isolates 54 5.9 Metabolic features of resistant isolates 55 5.10 Proteindifferentiation 56 5.10.1 Outer membrane proteins / SDS-PAGE 56 5.10.2 Qualitative protein assay 58 5.11 Inhibitiontesting 63 5.11.1 Inhibition of resistance by Phenylarginin-beta-Naphthylamide 63 5.11.2 Inhibition of resistance by 1- (1-naphtylmethyl) -piperazine 63 5.11.3 Inhibition of BKC-resistance by NMP 64 5.11.4 Inhibition der CHX-resistance by NMP 65 6 Discussion 66 6.1 Increased rate of resistance isolates 66 6.2 Distribution of resistant isolates 68 6.3 Influence of growth media 68 6.4 Bacteriocide properties of chlorhexidin towards E. coli 69 6.5 Induction of resistance through repetetive exposure 70 6.5.1 Induction of chlorehexidineresistance 70 6.5.2 Induction of benzalkoniumchloridresistance 71 6.5.3 Implications 72 6.6 Stability of resistance 72 6.7 Biocide cross resistance 73 6.8 Fermentation and biocide stress 73 6.9 Biocidresistance as a Co-factor for antibiotic resistance 74 6.10 Inhibition by Phenylarginin ß-Naphtalmide 77 6.11 Inhibition by 1- (1-methylnaphtyl) -piperazine 78 6.12 Proteindifferentiation from SDS-Gelelectrophoresis 79 6.12.1 Flagellin 79 6.12.2 Maltoporin 80 6.12.3 OMP 80 7 Summary 83 8 Appendix 84 9 References 86 10 Acknowledgment 100 12 Declaration of academic honesty 102