Untersuchung der proteolytischen Prozessierung von humanen Angiotensin-Peptiden

Abstract

Es war Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, ob Angiotensin 1-10 (A1-10) im Plasma durch humane Aminopeptidasen prozessiert wird und ob die hierdurch entstehenden Peptide biologische Wirkungen haben. Es gelang über einen Massenspektrometrie-basierten Enzym-Assay (MES-Assay) die Angiotensin-generierende Aktivitäten von Aminopeptidasen im Plasma nachzuweisen, die die sukzessive Generierung der Angiotensin-Peptide A2-10, A3-10, A4-10, A5-10 und A6-10 katalysieren. Der Nachweis der Generierung und der Existenz von A6-10 im Plasma gelang in dieser Arbeit das erste Mal. Eine A2-10- bzw. A3-10-generierende Aktivität wurde bisher lediglich in Säugetieren und in humanen kultivierten Zellen beschrieben. Die Präsenz einer A4-10- und A5-10-generierenden Aktivität war bisher im humanen Organismus nicht bekannt. Durch den Einsatz unterschiedlicher Proteaseinhibitoren konnte die Beteiligung verschiedener Plasmaproteasen an der Generierung dieser Angiotensin-Peptide gezeigt werden. Im Plasma existiert mindestens eine bestatin-insensitive Metalloprotease mit A6-10-generierender Aktivität sowie eine oder mehrere Proteasen der Cystein/Serin-Familie, welche die Angiotensin-Peptide A2-10, A3-10 und A4-10 generieren. Über Inkubationsexperimente mit einer rekombinanten Aminopeptidase N (APN) wurde beobachtet, dass die Peptide A3-10-, A4-10-, A5-10- und A6-10 aus A2-10 entstehen können, mit A6-10 als Endprodukt der proteolytischen Kaskade der APN. Deshalb ist wahrscheinlich die APN auch im Plasma an der Generierung dieser Peptide beteiligt. Eine Kombination chromatographischer und Immunofluoreszenz-basierter Methoden ermöglichte den Nachweis der Angiotensin-Peptide A4-10, A5-10 und A6-10 in humanem Plasma. A2-10 und möglicherweise auch A3-10 und A4-10 fungieren neben A1-8 als weitere Vorläufer-Peptide für die Generierung von A2-8, A3-8, A4-8, da diese letztgenannten Peptide nachweislich in humanem Plasma aus A2-10 generiert wurden. Es wurden Hinweise gesammelt, dass A2-10, A3-10, A4-10, A5-10 und A6-10 auch physiologische Funktionen haben. Hier konnte gezeigt werden, dass diese durch Aminopeptidaseaktivität entstandenen Angiotensin-Peptide in isolierten Blutgefäßen der Maus eine vasodilatierende als auch vasoprotektive Wirkung zeigen. Weitere physiologische Wirkungen dieser Peptide sind denkbar, wobei hier A6-10 als Endprodukt der proteolytischen APN-Kaskade und aufgrund dessen hoher Plasmakonzentrationen im Fokus steht. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse erweitern deutlich die Erkenntnis der vielfältigen Nutzung des Peptidhormonvorläufers A1-10 als Substrat für eine Reihe von physiologisch relevanten Peptidhormonen.

The aim of this work was to investigate if angiotensin (A1-10) is processed by aminopeptidases in human plasma and if these peptides are biologically active. Here, angiotensin-generating aminopeptidase activities which catalyzed the successive proteolytic generation of A2-10, A3-10, A4-10, A5-10 and A6-10 where determined successfully by a mass spectrometry assisted enzyme screening system assay (MES-assay). This work provides the first evidence of the generation and existence of A6-10 in plasma. Until now A2-10 and A3-10-generating activity was solely reported in mammals and in human cultured cells. Presence of A4-10 and A5-10-generating activity in human organism was not known before. By using different protease inhibitors participation of various plasma proteases was shown. At least one bestatin insensitive metalloprotease with A6-10-generating activity as well as one or more cysteine/serine proteases which are responsible for the generation of A2-10, A3-10 and A4-10 must exist. By incubation experiments with recombinant Aminopeptidase N (APN) it was shown that A6-10 appears as the final product of the proteolytic cascade of APN. Hence the participation of APN on the generation of these angiotensin-peptides in plasma is likely. A combination of chromatographic and immunofluorescence based methods enabled the detection of the angiotensin-peptides A4-10, A5-10 and A6-10 in human plasma. A2-10 and possibly also A3-10 and A4-10 serve as additional precursor peptides beside A1-8 for the generation of the peptides A2-8, A3-8 and A4-8 as the latter where found to be generated in human plasma from A2-10. The results in this work also suggested that A2-10, A3-10, A4-10, A5-10 and A6-10 also bear physiological functions. Here it could be shown that these aminopeptidase derived angiotensin-peptides exert vasodilating as well as vasoprotective actions on isolated mouse blood vessels. Further biological functions are conceivable. Here the focus concentrates on A6-10 as it was shown to be the endproduct of the proteolytic APN-cascade and is present in high plasma concentration. The results gained in this work clearly broaden the knowledge about the varied utilization of the peptide hormone precursor A1-10 as a substrate for a multitude of physiologically relevant peptide hormones.