Analyse der Auswirkungen von Aminosäuresubstitutionen im humanen CBL-Protein auf die Regulation des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR)

Abstract

Beim Noonan-Syndrom handelt es sich um ein autosomal-dominant erbliches Fehlbildungssyndrom, das durch Kleinwuchs, typische faziale Dysmorphien, angeborene Herzanomalien, Lernschwierigkeiten und eine Prädisposition für hämatologische Tumorerkrankungen gekennzeichnet ist. Bisher sind sechs Krankheitsgene für das Noonan-Syndrom bekannt: PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, NRAS und SHOC2. Heterozygote Mutationen in einem dieser Gene führen zu einer gesteigerten Signaltransduktion innerhalb des RAS (rat sarcoma) -MAPK (mitogen- activated protein kinase) -Signalweges. Keimbahnmutationen in CBL [Cas-Br-M (murine) ecotropic retroviral transforming sequence] wurden mit einem zum Noonan- Syndrom ähnlichen klinischen Bild in Verbindung gebracht. CBL codiert für ein multivalentes Adaptorprotein (c-Cbl) mit E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität, das an der Regulation des vesikulären Transports (Traffickings) vom epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGF-Rezeptor) beteiligt ist. Zum einen vermittelt c-Cbl über einen noch unbekannten Mechanismus die Vesikel-gestützte Endozytose (Internalisierung) des EGF-Rezeptors, zum anderen markiert c-Cbl durch Ubiquitylierung aktivierte EGF-Rezeptoren für den Lysosomen-vermittelten Abbau (Degradierung). EGF-Rezeptoren können darüber hinaus auch zurück zur Zellmembran dirigiert werden (Recycling). Über diese regulatorischen Eigenschaften ist c-Cbl an der Kontrolle von EGF-Rezeptor-abhängigen proliferativen Signalkaskaden, wie etwa des RAS-MAPK-Signalweges, beteiligt. Eine im ersten Teil der vorliegenden Arbeit durchgeführte DNA-Sequenzanalyse des CBL-Gens bei insgesamt 185 bisher mutationsnegativen Patienten mit Noonan- Syndrom bzw. dazu ähnlichem klinischem Bild ergab keine pathogene Mutation. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die funktionellen Auswirkungen der bereits beschriebenen krankheitsassoziierten CBL-Keimbahnmutationen c.1100A>C (p.K382E), c.1144A>G (p.D390Y) und c.1168G>T (p.R420Q) auf das EGF-Rezeptor- Trafficking analysiert. Hierfür wurden mithilfe PCR-vermittelter Mutagenese entsprechende CBL-cDNA-Konstrukte hergestellt und die entsprechenden Mutantenproteine in COS-7-Zellen transient exprimiert. In diesen Zellen wurde sodann das EGF-Rezeptor-Trafficking mithilfe von Rezeptor-Biotinylierungsassays untersucht. Dazu wurden vor oder nach EGF-Stimulation der Zellen die oberflächenständigen EGF-Rezeptoren biotinyliert, danach die internalisierte bzw. oberflächenständige EGF-Rezeptor-Fraktion durch Streptavidin-Präzipitation aufgereinigt und schließlich mittels Westernblot-Analysen quantifiziert. Es konnte nachgewiesen werden, dass alle untersuchten mutanten c-Cbl-Proteine zu einer verminderten EGF-induzierten EGF-Rezeptor-Internalisierung führen. Darüber hinaus war nach erfolgter EGF-Rezeptor-Internalisierung das intrazelluläre Trafficking der EGF-Rezeptoren verändert: Während die Überexpression von c- CblK382E das Recycling fördert und die EGF-Rezeptor-Degradierung beeinträchtigt, führen die Proteinmutanten c-CblD390Y und c-CblR420Q höchstwahrscheinlich zu einem verminderten Recycling und einer kurzfristig verzögerten EGF-Rezeptor- Degradierung. Zusammengenommen zeigt diese Studie, dass die untersuchten Mutationen in CBL markante Auswirkungen auf das EGF-Rezeptor-Trafficking haben, womit ein neuer molekularer Pathomechanismus zur Entstehung eines Noonan-Syndrom-ähnlichen Krankheitsbildes beschrieben werden kann.