Ocean acidification effects on marine microbial communities

Abstract

Anthropogenic CO2 emissions are causing an acidification of the world’s oceans. The consequences for marine organisms and especially heterotrophic bacteria remain under debate, and almost nothing is known concerning marine fungi. Both microbial groups are important players in organic matter decomposition and nutrient cycling, and their pH tolerance is known to be broad in relation to the predicted acidification. So far, ocean acidification effects on marine bacterial communities have mainly been investigated in large-scale mesocosm studies. In these systems, indirect effects mediated through complex food web interactions come into play. Until now, these experiments were not carried out in sufficient replication. In this thesis, we chose an alternative approach and investigated bacterial and fungal communities in highly replicated microcosm experiments (1-1.6 L). The duration of the experiments was four weeks. We incubated the natural microbial community from Helgoland Roads (North Sea) at in situ seawater pH, pH 7.82 and pH 7.67. These pH levels represent the present-day situation and acidification at atmospheric CO2 of 700 or 1000 ppm, projected for the southern North Sea for the year 2100. For the bacterial community, different dilution approaches were used to select for different ecological groups. Seasonality was accounted for by repeating the experiment four times (spring, summer, autumn, winter). In a second experiment repeated in two consecutive years, we investigated direct pH effects on marine fungal communities. We additionally isolated marine yeasts and identified them by Matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and partial sequencing of the large subunit (LSU) rRNA gene. To reveal changes in community structure, we applied the culture-independent fingerprint method automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) for both bacteria and fungi. Bacterial communities were furthermore analyzed by 16S ribosomal amplicon pyrosequencing. Abundances were determined by flow cytometry (bacteria) and colony forming unit counts (fungi). To be able to interpret results comprehensively, we determined the natural variability of the carbonate system at Helgoland Roads over a yearly cycle. We found that from September 2010 to September 2011, pH at Helgoland Roads ranged from 8.06 to 8.43, corresponding to partial pressures of carbon dioxide (pCO2) of 215-526 µatm. The acidification predicted for the year 2100 consequently represents a strong perturbation of the system. Bacterial communities developing in the microcosms were primarily influenced by season and dilution, demonstrating that diverse communities had been generated. We predominantly found pH-dependent shifts in bacterial community structure already at pH 7.82. Groups involved in these shifts were different members of Gammaproteobacteria, Flavobacteriaceae, Rhodobacteraceae, Campylobacteraceae and further less abundant groups. While Rhodobacteraceae were consistently less characteristic for reduced pH, Campylobacteraceae profited from pH reduction. For most other bacterial groups however, pH effects were context-dependent, i.e. dependent on season, dilution or an interaction of effects. Regarding bacterial abundance, no pH effect was found. Fungal community structure was significantly different between both years of the experiment, hinting at inter-annual variability. Shifts in response to pH occurred predominantly only at pH 7.67. In contrast, a strong pH effect was observed on fungal abundance. In comparison to in situ pH, fungal numbers were on average 9 times higher at pH 7.82 and 34 times higher at pH 7.67. Concerning marine yeasts, Leucosporidium scottii, Rhodotorula mucilaginosa and related species, as well as Cryptococcus sp. and Debaromyces hansenii reacted positively to low pH. Our findings demonstrate that already small reductions in pH have direct effects on both bacterial and fungal communities. A tipping point for community shifts appears to be reached earlier for bacteria than for fungi. Regarding bacteria and yeasts, both naturally abundant groups and rare species were affected by pH reductions. The strong increase in fungal numbers at reduced pH suggests that with ocean acidification, marine fungi may reach higher importance in marine biogeochemical cycles and as infectious agents. Using a microcosm approach, a robust analysis of direct ocean acidification effects on marine bacterial and fungal communities was accomplished. Results yield valuable hypotheses to test in future large-scale and long-term studies.

CO2-Emmissionen anthropogenen Ursprings sind Hauptverursacher für die Versauerung der Weltmeere. Ihre Auswirkungen auf marine Organismen und speziell auf heterotrophe Bakterien sind unklar und es gibt bisher kaum Untersuchungen im Bezug auf marine Pilze. Sowohl Bakterien als auch Pilze spielen eine wichtige Rolle beim Abbau von organischem Material sowie in Nährstoffkreisläufen, und beide Gruppen tolerieren weite pH-Bereiche. Bisher wurden die Effekte der Ozeanversauerung auf marine Bakteriengemeinschaften vor allem in Mesokosmos-Studien untersucht. In diesen komplexen Systemen kommen indirekte Effekte durch Nahrungsnetz-Interaktionen ins Spiel. Diese Experimente lassen sich außerdem aus logistischen Gründen bisher nur gering repliziert durchführen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher ein alternativer Ansatz verfolgt und Ozeanversauerungs-Effekte auf Bakterien- und Pilzgemeinschaften in hochreplizierten, vierwöchigen Mikrokosmos-Experimenten (1-1.6 L) untersucht. Der Fokus lag auf den natürlichen mikrobiellen Gemeinschaften der Helgoländer Reede (Nordsee), die bei in situ pH, pH 7.82 und pH 7.67 inkubiert wurden. Diese pH-Abstufungen entsprechen der heutigen Situation sowie der für die südliche Nordsee für das Jahr 2100 vorausgesagten Versauerung. Für Bakteriengemeinschaften wurden verschiedene Verdünnungsansätze gewählt, um unterschiedliche ökologische Gruppen zu selektieren. Um saisonale Unterschiede zu berücksichtigen wurde das Experiment außerdem an vier Zeitpunkten des Jahres wiederholt. In einem zweiten Experiment in zwei aufeinanderfolgenden Jahren wurden direkte pH-Effekte auf marine Pilzgemeinschaften untersucht. Neben der Betrachtung der gesamten Pilzgemeinschaft wurden zusätzlich Hefen isoliert und mittels MALDI-TOF MS und partieller Sequenzierung des LSU rRNA-Gens identifiziert. Um Änderungen der Gemeinschaftsstruktur der jeweiligen Gruppen aufzuklären wurde mit jeweils bakterien- bzw. pilzspezifischen Primern die kultivierungsunabhängige Fingerprint-Methode ARISA angewandt. Bakterielle Gemeinschaften wurden darüber hinaus mittels 16S rRNA-Gen-Pyrosequenzierung analysiert. Die Abundanzen wurden durch Durchflusszytometrie (Bakterien) und Koloniezahlbestimmung (Pilze) ermittelt. Um die Ergebnisse umfassend interpretieren zu können wurde zudem die natürliche Variabilität des Karbonat-Systems an der Helgoländer Reede über einen Jahresverlauf bestimmt. Von September 2010 bis September 2011 variierte der pH an der Helgoländer Reede von 8.06 bis 8.43, was einem CO2-Partialdruck (pCO2) von 215-526 µtm entspricht. Demnach stellt die vorausgesagte Versauerung eine starke Veränderung des Systems dar. Die Bakteriengemeinschaften in den Mikrokosmen waren vor allem von der Jahreszeit und dem Verdünnungsansatz abhängig. Darüber hinaus gab es einen signifikanten pH-Einfluss, überwiegend schon bei pH 7.82. Repräsentativ für diese Änderungen waren Mitglieder der Gammaproteobacteria, Flavobacteriaceae, Rhodobacteraceae, Campylobacteraceae und weitere weniger abundante Gruppen. Während Rhodobacteraceae generell weniger charakteristisch für einen niedrigen pH waren, profitierten Campylobacteraceae von einer pH-Erniedrigung. Für die meisten anderen bakteriellen Gruppen waren die pH-Effekte dagegen Kontext-abhängig, d.h. abhängig von der Jahreszeit, dem Verdünnungsansatz oder einer Wechselwirkung mehrerer Effekte. Unterschiedliche pH-Werte hatten keinen Effekt auf die Bakterienzahlen. Die Struktur der Pilzgemeinschaft unterschied sich in beiden Jahren signifikant. pH-abhängige Änderungen traten in den meisten Fällen allerdings erst bei pH 7.67 auf. Im Gegensatz dazu wurde ein starker pH-Effekt auf die Abundanzen der Pilze beobachtet. Gegenüber dem in situ pH waren diese im Durchschnitt bei pH 7.82 um den Faktor neun und bei pH 7.67 um den Faktor 34 erhöht. Unter den marinen Hefen reagierten Leucosporidium scottii, Rhodotorula mucilaginosa und verwandte Arten, Cryptococcus sp. und Debaromyces hansenii positiv auf einen niedrigeren pH-Wert. Die Ergebnisse zeigen dass schon eine geringe Erniedrigung des pH-Wertes einen direkten Effekt auf sowohl Bakterien- als auch Pilzgemeinschaften hat. Hierbei scheint eine Änderung der Bakteriengemeinschaft im Gegensatz zu Pilzen bereits bei geringeren pH-Unterschieden aufzutreten. Eine Erniedrigung des pH-Wertes hatte bei Bakterien und Hefen Auswirkungen sowohl auf natürlich abundante als auch auf seltene Arten. Die Zunahme von Pilzen weist darüber hinaus darauf hin, dass marine Pilze durch die Ozeanversauerung sowohl in marinen biogeochemischen Stoffkreisläufen an Bedeutung gewinnen könnten, als auch als Krankheitserreger eine wichtigere Rolle spielen könnten. Im Rahmen eines hoch-replizierten Mikrokosmos-Ansatzes wurde eine robuste Analyse der direkten Ozeanversauerungs-Effekte auf marine Bakterien- und Pilzgemeinschaften erreicht. Die Resultate führen zu wertvollen Hypothesen, die in zukünftigen Mesokosmos und Langzeit-Experimenten getestet werden sollten.