Funktionelle Analyse des "Apikalen Membran Antigens 1" (AMA1) : Untersuchung zur Rolle der Phosphorylierung des Vakzinkandidaten im Malariaerreger Plasmodium falciparum (Welch, 1897)

Abstract

Malaria ist mit über 300 Million Neuinfektionen und etwa 1 Million krankheitsbedingter Todesfälle eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten der Gegenwart. Auslöser sind Parasiten der Gattung Plasmodium, welche in der Lage sind Erythrozyten zu invadieren und zu modifizieren. Die Invasion ist ein präzise koordinierter Prozess, der auf der genauen Abfolge von Proteinsekretion und spezifischer Protein-Protein Interaktionen beruht. Rezeptor-Phosphorylierung scheint dabei ein wichtiger Regulationsmechanismus zu sein. Dies wurde unter Anderem für den Vakzinkandidaten "apikale membran antigen 1" (AMA1) gezeigt. Das Typ-I-Transmembranprotein bindet mit seiner extrazellulären Domäne an einen Rezeptor-Komplex in der Erythrozytenmembran, was die Voraussetzung für die Invasion der Wirtszelle durch den Parasiten ist. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Phosphorylierung der zytoplasmatischen Domäne (CPD) von AMA1 an Serin 610 durch die Proteinkinase A (PKA) essentiell für die Funktion des Proteins ist. Mehrere unabhängige Untersuchungen konnten in der CPD von AMA1 neben S610 noch 5 weitere putative Phosphorylierungsstellen nachweisen. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung dieser zusätzlichen Phosphorylierungsstellen in Hinsicht auf deren physiologische Funktion und die identifizierung der verantwortlichen Kinase(n). Durch die Herstellung von Substitutionsmutanten konnte gezeigt werden, dass die Serine S588, S601 und S590 in vivo keinen Einfluss auf die Funktion von AMA1 während der Erythrozyteninvasion haben. Dies steht im Gegensatz zu den Mutationen der Threonine T612 und T613, die zu einer 40 %igen bzw. 70 %igen Invasionsinhibition führten. Es konnte gezeigt werden, dass die quantitative Phosphorylierung von T613 erst nach der initialen Phosphorylierung von S610 durch die cAMP-abhängige ProteinkinaseA nachweisbar ist. Als potenzielle Kinase für die T613-Phosphorylierung wurde die "Glykogen Synthase Kinase 3" (GSK3) genauer charakterisiert, da der Bereich um T613 einer GSK3 Substrat-Erkennungsstelle ähnelt. Die GSK3 kann vor-phosphoryliertes Substrat weiter phosphorylieren, wird im intraerythrozytären Zyklus exprimiert und ist für diesen essentiell. Es konnte gezeigt werden, dass die rekombinante GSK3 AMA1 T613-abhängig phosphoryliert und dass das Enzym in Schizonten zytosolisch exprimiert wird. Die Aktivierung von AMA1 scheint somit ein Zwei-Stufen-Prozess zu sein, in dem nicht nur die PKA sondern auch die GSK3 eine entscheidende Rolle spielt.