Molekulare und funktionelle Adaptation von Hirntumorstammzellen aus dem humanen Glioblastom an Hypoxie und Oxygenierung

Abstract

Glioblastome, die häufigsten und malignesten humanen Hirntumore, sind hypoxische Tumore. Die Sauerstoffkonzentration fluktuiert jedoch lokal, was eine metabolische Herausforderung für Tumorzellen darstellt. Es wird angenommen, dass Tumorstammzellen des Glioblastoms über eine außergewöhnliche metabolische Flexibilität verfügen, die es ihnen ermöglicht das Tumorwachstum selbst unter ungünstigen Wachstumsbedingungen zu initiieren und aufrechtzuerhalten. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen der Adaptation an akute und chronische Hypoxie sowie Oxygenierung in Glioblastomstammzellen (GS-Zellen) untersucht. Dazu wurden aus 4 Glioblastomen GS Zelllinien parallel unter chronisch normoxischen (GSN) und chronisch hypoxischen Bedingungen (GSH) etabliert (GS-10N und GS-10H bis GS-13N und GS-13H). Diese Linien wurden anschließend zur Simulation fluktuierender Sauerstoffkonzentrationen akuter Normoxie (GS-10HN bis GS-13HN) bzw. akuter Hypoxie (GS-10NH bis GS-13NH) ausgesetzt. Die Charakterisierung der parallelen chronisch adaptierten Zelllinien zeigte, dass die Ausprägung von Stammzelleigenschaften wie Tumorinitiierung sowie die Expression von Stammzellmarkern in den GSH-Linien gegenüber den GSN-Linien verstärkt war. Genexpressionsanalysen mittels Mikroarrays ergaben, dass akute Hypoxie hauptsächlich zur Induktion von Genen führte, die mit metabolischen Prozessen und Prozessen der Zellzyklusinhibition assoziiert waren. Demgegenüber induzierte chronische Hypoxie vor allem die Expression von Genen, die in Prozesse der neuralen Entwicklung involviert waren. Anschließende detaillierte bioinformatische Analysen der Genregulation sowie konfirmatorische quantitative Real-Time PCR und Western Blot Analysen zeigten konsistent eine erhöhte Expression von Glykolyseenzymen, insbesondere Enzymen aus der Vorbereitungsphase der Glykolyse, unter akuter Hypoxie. Im Gegensatz dazu konnte für Enzyme des Pentosephosphatwegs (PPP) eine Herunterregulation unter akuter Hypoxie festgestellt werden. Das entgegengesetzte Expressionsmuster zeigte sich nach akuter Oxygenierung chronisch hypoxischer Linien. In silico Analysen unter Verwendung der REMBRANDT Datenbank ergaben überraschenderweise, dass die Expression von PPP-Enzymen, trotz ihrer Herunterregulation unter Hypoxie, in Glioblastomen gegenüber Normalhirn erhöht war. Demgegenüber konnte eine verringerte Expression von hypoxieinduzierten Glykolyseenzymen der parallelen Vorbereitungsphase festgestellt werden. Immunhistologische Untersuchungen an einem Gliom Gewebe-Mikroarray konnten dieses Expressionsmuster anhand der zwei am stärksten durch Hypoxie regulierten Enzyme (ALDOC der Glykolyse und G6PD des PPP) bestätigen. Nachfolgende immunhistologische Färbungen zeigten zudem eine besonders starke Expression von PPP-Enzymen in den Hauptanteilen von Glioblastomen, vor allem in hochproliferativen Bereichen, jedoch nur eine schwache Expression in den stark hypoxischen Pseudopalisaden. Für Glykolyseenzyme konnte das entgegengesetzte Expressionsmuster nachgewiesen werden. Hier zeigte sich eine starke Expression in Pseudopalisaden, aber nur eine sehr schwache Expression im umliegenden Tumorgewebe. Mittels massenspektrometrischer Analysen unter Verwendung von [1,2-13C2]-D-Glucose konnte zudem unter akuter Hypoxie ein reduzierter Glucosefluss über den PPP zugunsten eines erhöhten Flusses über die Glykolyse festgestellt werden. Funktionelle Untersuchungen ergaben, dass akute und chronische Hypoxie die Zellmigration erhöhten, aber die Zellproliferation reduzierten, wohingegen Normoxie entgegengesetzte Effekte hatte. Des Weiteren konnte mittels shRNA-vermittelter Herunterregulation von ALDOC bzw. G6PD und durch spezifische Inhibitoren gegen Enzyme der Glykolyse oder des PPP gezeigt werden, dass eine Inhibition der Glykolyse in GS-Zellen mit einer schnelleren Proliferation, einer verringerten Migration, aber einem schnelleren Tumorwachstum in vivo einherging, wohingegen die Inhibition des PPP den entgegengesetzten Effekt hatte. Zusammenfassend erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit Warburgs Beobachtungen, dass Tumorzellen bevorzugt die Glykolyse zur ATP-Produktion nutzen, denn es konnte gezeigt werden, dass in hochgradig proliferativ aktiven Glioblastomzellen der anabole PPP relativ stark aktiv ist, dieser allerdings unter akuter schwerer Hypoxie supprimiert wird, wodurch es zur Verschiebung der Stoffwechselwege hin zur direkten Glykolyse kommt. Diese Verschiebung stellt die zelluläre Antwort auf hypoxischen Stress dar, und es ist zu vermuten, dass die verstärkte direkte Glykolyse durch eine erhöhte ATP-Produktion, eine aktive Suppression der Zellatmung und eine Steigerung der Migrationsfähigkeit die Tumorzelle vor hypoxischen Zellschädigungen schützt.

Glioblastomas (GBM), the most frequent and most malignant human brain tumors, are hypoxic tumors. However, oxygen levels fluctuate during tissue remodelling, imposing a major metabolic challenge for cancer cells. Stem-like tumor cells in GBM are believed to possess extraordinary metabolic flexibility, enabling them to initiate growth even under non-permissive conditions. In the presented dissertation mechanism of metabolic adaptation to acute and chronic hypoxia as well as oxygenation were analysed. For that purpose we established and propagated stem-like glioblastoma cell lines (GS-cell lines) either under normoxia (GS-10N to GS-13N) or hypoxia (GS-10H to GS-13H) and subsequently exposed these stable cell lines to acute normoxia (GS-10HN to GS-13HN) or hypoxia (GS-10NH to GS-13NH), respectively. The detailed characterisation of the chronically normoxic and hypoxic GS-cell lines showed that stem cell properties, such as tumor initiation and the expression of stem cell markers, were enhanced in the parallel hypoxic GS-cell lines (GSH) compared to normoxic ones (GSN). Gene expression profiling (Affymetrix) revealed that acute hypoxia predominantly induced expression of genes associated with metabolic pathways and cell cycle arrest, whereas chronic hypoxia induced the expression of genes involved in neurodevelopmental processes. Bioinformatic analyses and subsequent confirmative qPCR and Western Blot studies consistently demonstrated increased expression of glycolytic enzymes, especially of the preparatory phase of glycolysis, under acute hypoxia, whereas pentose phosphate pathway (PPP) enzymes were downregulated. The opposite pattern was found for acute oxygenation. Unexpectedly, REMBRANDT database analysis showed that despite downregulation by hypoxia, expression of PPP enzymes was increased in GBM, whereas expression of hypoxia-inducible enzymes of the parallel preparatory phase of glycolysis was decreased. Immunhistolocal analyses using a glioma tissue microarray of the two most strongly regulated enzymes (ALDOC of glycolysis und G6PD of the PPP) confirmed the observed expression pattern. Furthermore, immunohistochemistry showed strong staining for PPP enzymes in most areas of GBM tissue, especially in highly proliferative regions, but only weak expression in hypoxic pseudopalisading cells. Glycolytic enzymes displayed an inverse pattern with increased expression in hypoxic pseudopalisades but only weak expression in the surrounding tumor tissue. Mass spectrometric analysis using [1,2-13C2]-D-glucose showed reduced glucose flux through the PPP under hypoxia in favor of flux through glycolysis. Functionally, acute and chronic hypoxia increased cell migration but reduced proliferation, whereas normoxia had opposite effects. Subsequent analyses using shRNA-mediated downregulation of ALDOC and G6PD, respectively, or specific inhibitors against glycolytic or PPP enzymes indicated that inhibition of glycolysis was associated with increased proliferation, decreased migration but increased tumor growth in vivo, whereas the inhibition of the PPP had opposite effects. Collectively, the findings of this thesis extend Warburg’s observation that tumor cells predominantly utilize the glycolytic pathway for energy production, by suggesting that the anabolic PPP is highly active in rapidly proliferating cells in order to meet the demand of macromolecules for the rapid cell division but is suppressed under acute severe hypoxic stress, switching to direct glycolysis. This switch most likely represents a cellular response to hypoxic stress and protects cells against hypoxic cell damage by increasing ATP production, suppressing cell respiration and enhancing cell migration.