Modulation der Apoptose durch die Proteine m41 und m41.1 des murinen Cytomegalievirus

Abstract

Der Lokus m41 des murinen Cytomegalievirus (MCMV) kodiert für zwei Proteine, m41 und m41.1. Die Sequenz des Proteins m41.1 überlappt vollständig mit der Sequenz des Proteins m41, liegt jedoch in einem anderen Leserahmen. Bisherige Untersuchungen zeigten, dass beide Proteine in unterschiedlichen Kompartimenten der Zelle lokalisiert sind. m41 wurde am Golgi-Apparat nachgewiesen, wohingegen m41.1 am Mitochondrium lokalisiert ist. Für beide Proteine wurde außerdem eine antiapoptotische Funktion in der MCMV-Infektion beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde die antiapoptotische Funktion der MCMV-Proteine m41 und m41.1 näher untersucht. Im ersten Schritt wurden zelluläre Interaktionspartner von m41 und m41.1 identifiziert. Im Fall des Proteins m41 wurden als Suchverfahren die α-HA-Affinitätsaufreinigung gekoppelt an eine massenspektrometrische Analyse und ein Yeast-two-Hybrid-Verfahren angewandt. Dadurch identifizierte Kandidaten wurden weitergehend getestet. Für das Protein m41.1 konnte mithilfe der Koimmunpräzipitation das zelluläre, proapoptotische Protein BAK als Interaktionspartner identifiziert werden. Im zweiten Schritt wurde die antiapoptotische Funktion von m41 und m41.1 in der MCMV-Infektion in Zellkultur näher charakterisiert. Interessanterweise konnte hierbei die beschriebene antiapoptotische Funktion des Proteins m41 nicht bestätigt werden. Das Protein m41.1 hingegen zeigte eine eindeutige antiapoptotische Funktion in infizierten Makrophagen und Fibroblasten. In Zusammenarbeit mit Maren Cam wurde detailliert gezeigt, dass m41.1 die BAK-vermittelte mitochondriale Apoptose in vitro hemmt. Zusätzlich wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Virusmutanten konstruiert, mit denen die Rolle des Proteins m41.1 in der in vivo Infektion untersucht werden konnte. Die Infektionsexperimente mit diesen Virusmutanten wurden von Branka Popovic und Christina Luig durchgeführt und zeigten, dass m41.1 essentiell für eine optimale Dissemination von MCMV in der Maus ist.

The m41 locus of the murine cytomegalovirus (MCMV) encodes two proteins, m41 and m41.1. The m41.1 coding sequence overlaps completely with the coding sequence of m41, whereas the resulting proteins are encoded in different frames. Previous studies have shown that both proteins are expressed in different cell compartments. The m41 protein is localized at the Golgi apparatus in contrast to the m41.1 protein, which is expressed at the mitochondria. However, it has been shown that both proteins possess an antiapoptotic function during MCMV infection. In the present thesis the antiapoptotic function of both, the m41 and the m41.1 protein, was investigated in detail. For this purpose, firstly, cellular proteins were identified which interact with either m41 or m41.1. The search for m41 interaction partners was performed using two different screening methods, an α-HA affinity purification coupled with mass spectrometry analysis and a yeast-two-hybrid screen. Subsequently putative interaction partners were verified. For the m41.1 protein the interaction with the cellular protein BAK was identified by immunoprecipitation. In a second step the antiapoptotic effects of m41 and m41.1 were characterized in cell culture based experiments. Interestingly, the described antiapoptotic function of the m41 protein could not be confirmed. Nevertheless, the m41.1 protein showed a distinct antiapoptotic effect during MCMV infection of macrophages and fibroblasts. In cooperation with Maren Cam it could be shown that m41.1 inhibits mitochondria-mediated apoptosis in a BAK dependend manner in vitro. Furthermore this thesis describes the construction of virus mutants for in vivo studies. Infection experiments using those mutants showed the importance of the m41.1 protein in the infection of mice. In collaboration with Branka Popovic and Christina Luig it could be shown that m41.1 is essential for the optimal dissemination of MCMV in infected mice.