Detection of Impaired Homologous Recombination Repair inNSCLC Cells and Tissues

Abstract

Introduction: Homologous recombination repair (HRR) is a critical pathway for the repair of DNA damage caused by cisplatin or poly- ADP ribose polymerase (PARP) inhibitors. HRR may be impaired by multiple mechanisms in cancer, which complicates assessing the functional HRR status in cells. Here, we monitored the ability of non–small-cell lung cancer (NSCLC) cells to form subnuclear foci of DNA repair proteins as a surrogate of HRR proficiency. Methods: We assessed clonogenic survival of 16 NSCLC cell lines in response to cisplatin, mitomycin C (MMC), and the PARP inhibitor olaparib. Thirteen tumor explants from patients with NSCLC were subjected to cisplatin ex vivo. Cells were assayed for foci of repair-associated proteins such as BRCA1, FANCD2, RAD51, and γ-H2AX. Results: Four cell lines (25%) showed an impaired RAD51 fociforming ability in response to cisplatin. Impaired foci formation correlated with cellular sensitivity to cisplatin, MMC and olaparib. Foci responses complemented or superseded genomic information suggesting alterations in the ATM/ATR and FA/BRCA pathways. Because baseline foci in untreated cells did not predict drug sensitivity, we adapted an ex vivo biomarker assay to monitor damageinduced RAD51 foci in NSCLC explants from patients. Ex vivo cisplatin treatment of explants identified two tumors (15%) exhibiting compromised RAD51 foci induction. Conclusions: A fraction of NSCLC harbors HRR defects that may sensitize the affected tumors to DNA-damaging agents including PARP inhibitors. We propose that foci-based functional biomarker assays represent a powerful tool for prospective determination of treatment sensitivity, but will require ex vivo techniques for induction of DNA damage to unmask the underlying HRR defect.

Das Bronchialkarzinom ist eine der häufigsten Todesursachen in Deutschland und die führende Ursache Krebs-assoziierter Sterbefälle. Mehr als eine Millionen Fälle des Bronchialkarzinoms werden weltweit jedes Jahr diagnostiziert (1,2). Mit einem Anteil von 85% an allen Lungenkrebsfällen ist das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom (non small cell lung cancer, NSCLC) die häufigste Form dieser Erkrankung (3). Eine Vielzahl dieser Tumoren wird erst im Stadium III und höher diagnostiziert und ist dann chirurgisch nicht mehr zu kurieren. Die wichtigste Säule der Therapie von diesen Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem Lungenkrebs stellt heutzutage die Platin-basierte Chemotherapie dar. Diese hat jedoch nur eine Ansprechrate von 15-35% und die 5-Jahres Überlebensrate beträgt lediglich 14%, woraus sich ein dringender Bedarf bezüglich der Erforschung von neuartigen Wegen der Therapieoptionen ergibt (4-6). Neueste Erkenntnisse weisen darauf hin, dass zelluläre Defekte in DNAReparaturwegen, welche zu genomischer Instabilität und somit zur malignen Transformation einer Zelle führen können, jedoch in gleicher Weise auch die betroffenen Zellen für exogene DNA-Schädigung durch Chemotherapeutika oder Bestrahlung sensibilisieren (7-9). Dies konnte für den Signalweg der Homologen Rekombination (HR) gezeigt werden, einem wichtigen zellulären Mechanismus zur fehlerfreien Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB) und Blockaden der Replikation wie sie z. B. durch platinhaltige Substanzen ausgelöst werden (10,11). Ein wichtiges Merkmal der Homologen Rekombination und anderer DNAReparaturmechanismen ist die räumliche und zeitliche Organisation der in dem jeweiligen Signalweg involvierten Proteinfaktoren am Ort von beschädigter DNA (12). Somit kommt es als Antwort auf eine DNA-Schädigung zu einer Akkumulation von Proteinen, die sich im Zellkern zu mikroskopisch sichtbaren „Foci“ formieren. In nicht geschädigten Zellen ist deren Anzahl gering. Die Fähigkeit einer Zelle zur Formation dieser „Reparaturfoci“ kann somit dazu dienen, Auskunft über Funktionalität oder Defekt des Signalweges von DNA-Reparaturmechanismen zu erhalten und könnte sich daher als prädiktiver Biomarker zur Einschätzung von Sensibilität oder Resistenz von Tumorzellen gegenüber Cisplatin und anderen Chemotherapeutika eignen. In dieser Arbeit werden funktionell relevante Defekte im Signalweg der Homologen Rekombination in verschiedenen nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen- und Gewebe untersucht. Dazu wird, als Antwort auf DNA-Schäden, die Fähigkeit von Tumorzellen zur Formation vom Reparaturfoci (v.a. Rad51und γ-H2AX) untersucht, welche eine zentrale Rolle im Signalweg der Homologen Rekombination bzw. der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielen (12,13). Dies dient dem Ziel zelluläre Tumormarker zu identifizieren, welche vorhersagen können, ob ein Tumor mit hoher Wahrscheinlichkeit auf eine platinbasierte Chemotherapie ansprechen wird. Klinisch könnten dadurch in Zukunft Patienten ausgeschlossen werden, die voraussichtlich nicht von einer solchen Therapie profitieren, sodass ihnen die schweren Nebenwirkungen einer platinbasierten Chemotherapie wie Nephro- und Neurotoxizität erspart blieben.