Induktion der Resistenz gegenüber dem Weizenpathogen Fusarium graminearum durch gezielte Zellwandveränderungen in Brachypodium distachyon

Abstract

Die zunehmende Verbreitung der Pflanzenkrankheit Fusarium Head Blight, hauptsächlich verursacht durch den phytopathogenen Pilz Fusarium graminearum, führt zu hohen Ernteverlusten und einer Belastung des Getreides mit Mykotoxinen. Da die Kontrolle der Krankheit nur unzureichend mit Fungiziden erfolgen kann, liegt der Fokus auf der Züchtung von resistenteren Getreidesorten mit dem Hauptaugenmerk auf Weizen. Allerdings werden Analysen der Interaktion zwischen F. graminearum und Getreide durch die genetische Unzugänglichkeit insbesondere in Weizen erschwert. Als Lösung wurde Brachypodium distachyon vorgeschlagen, das neben den wichtigen Eigenschaften eines Modellorganismus, auch genetisch zugänglich ist und relativ einfach transformiert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte durch die Analyse der Infektion eines F. graminearum Wildtyp-Stammes, sowie definierter Deletionsmutanten, die Eignung von B. distachyon als Modell für die F. graminearum – Weizen Infektion bestätigt werden. Dabei verhielt sich F. graminearum bezüglich des Infektionsverlaufs und der DON-Produktion wie bereits für Weizen beschrieben. Während der Wildtyp B. distachyon-Ährchen erfolgreich kolonisieren konnte, konnten sich sowohl die DON-defiziente Mutante Δtri5, als auch die Lipase-Deletionsmutante Δfgl1, die Wildtyp-ähnliche Mengen des Mykotoxins DON produzierte, nur in der inokulierten Blüte ausbreiten. Der Knock-out der MAP-Kinase Δgmpk1 verhielt sich wie auf Weizen auch auf B. distachyon apathogen. Um die pflanzliche Seite der Interaktion näher zu charakterisieren, wurden mögliche Veränderungen der pflanzlichen Zellwand, die die erste wichtige Barriere gegen pilzliche Pathogene darstellt, analysiert. Die alkoholunlöslichen Bestandteile der Zellwand wurden dafür aufgereinigt und die Hemicellulosen hydrolisiert. Anschließend wurden die zugrundeliegenden Monosaccharide mittels Anionenaustausch-Chromatographie mit gekoppelter, gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) bestimmt. 14 Tage nach der Infektion (dpi) mit F. graminearum konnte in den inokulierten B. distachyon-Ährchen nur für die DON-produzierenden Stämme Wildtyp, Δfgl1- und Δgmpk1-Mutante ein Anstieg der Glucosemenge beobachtet werden. Durch eine Inokulation mit DON konnte die Induktion der Glucose auf das Mykotoxin zurückgeführt werden. Dabei zeigte die geringste DON-Konzentration von 1 ppb den höchsten Anstieg. Da eine Vorbehandlung der Ähren mit DON zu einer signifikanten Reduktion der anschließenden Wildtyp-Infektion führte, wird für das Mykotoxin eine Dosis-abhängige Induktion der Pathogenabwehr, ähnlich der effector-triggered immunity, vorgeschlagen. Als Teil der basalen Pathogenabwehr wird das Zellwandpolymer Callose zwischen der Plasmamembran und der Zellwand gebildet. Auch in B. distachyon konnte eine Anreicherung von Callose nach einer F. graminearum-Infektion beobachtet werden. Während 7 Tage nach der Wildtyp-Inokulation die höchste Callosekonzentration B. distachyon-Ährchen beobachtet werden konnte, stach zum frühen 3 Tage Zeitpunkt besonders die Δfgl1-Mutante hervor. Diese zeigte vermehrte Calloseablagerungen im Rachillaknoten, dem Übergang von der Blüte zur Ährchenachse. Damit entsprachen auch die Calloseablagerungen in B. distachyon nach einer F. graminearum-Infektion den in Weizen beschriebenen. Die zusätzliche Integration der Stress-induzierten Callosesynthase AtGSL5 aus Arabidopsis thaliana führte in B. distachyon zu einer stark erhöhten Callosebildung im Rachillaknoten nach einer F. graminearum-Infektion im Vergleich zur Wildtyp-Pflanze. Zudem konnte eine Erhöhung der Typ II-Resistenz gegenüber einer F. graminearum-Infektion beobachtet werden, die die Bedeutung von Calloseablagerungen während dieser in B. distachyon verdeutlichen. Ein erster Schritt um die Ergebnisse auf Weizen zu übertragen, war die Identifizierung endogener Callosesynthasen aus B. distachyon. Unter den 11 putativen Callosesynthasen konnte durch Expressionsanalysen BdGSL2 identifiziert werden, die eine mögliche homologe Funktion zu AtGSL5 aufweist.

Increasing outbreaks of the severe plant disease Fusarium Head Blight on cereals mainly caused by the fungal plant pathogen Fusarium graminearum lead to massive losses of yield and a contamination of grains with mycotoxins. Due to the insufficient disease control based on fungicides, the breeding of more resistant cereals gains more and more importance. But the investigation of the interaction between F. graminearum and cereals, esp. wheat, was always limited by the genetic inaccessibility of these plants. Recently Brachypodium distachyon was introduced as a sufficient model system for the temperate grasses, which can easily be transformed. Within this work the suitability of B. distachyon as a model for the pathosystem F. graminearum – wheat has been approved, by analysing the infection pattern of a F. graminearum wild type strain as well as predefined mutant strains. F. graminearum showed the same disease phenotype and DON production as previously reported. While the wild type was able to colonize B. disachyon spikelets successfully, both, the DON deficient Δtri5 mutant and the lipase deletion mutant Δfgl1, which showed wild type-like DON production, were only able to infect the inoculated floret. The MAP kinase deletion mutant Δgpmk1 showed in B. distachyon an apathogenic phenotype as previously reported from wheat. To characterize the plant defense of this interaction in more detail, cell wall alterations have been analyzed as the cell wall represents the first effective barrier against intruding fungal pathogens. The alcohol insoluble residues of the cell walls were prepared and the hemicelluloses were hydrolyzed. Afterwards the monosaccharide composition was determined by high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). 14 days post-inoculation (dpi) an increased amount of glucose was detected in the inoculated spikelets only for the DON-producing strains wild type, Δfgl1 and Δgpmk1 in the inoculated spikelets. Due to the results from DON inoculation a linkage between the induction of the glucose and the mycotoxin was observed. Application of the lowest DON concentration of 1 ppb induced the strongest increase. Additionally F. graminearum wild type infection was significantly reduced on spikelets that were pretreated with DON. This suggests that the mycotoxin DON can induce a dose-dependent effector-triggered like immunity in the host plant, which is associated with cell wall changes. A common defense response in plants is the deposition of the cell wall polymer callose between the plasma membrane and the cell wall. Comparable to wheat an enrichment of callose was detected after a F. graminearum infection in B. distachyon. While the highest amount of callose was observed in wild type-inoculated B. distachyon spikelets at 7 dpi, the callose content of the Δfgl1 mutant was prominent at 3 dpi. In comparison to the wild type, the mutant showed an increased callose deposition in the rachilla node, the transition zone from the floret to the rachilla. The integration of AtGSL5, a callose synthase from A. thaliana, led to an enhanced callose deposition after a F. graminearum infection in comparison to the wild type plant. Furthermore, an enhanced type II resistance was observed, which further supports the importance of callose deposition during a F. graminearum infection in B. distachon. The identification of endogenous callose synthases from B. distachyon was a first crucial step to transfer the results onto wheat. Based on expression studies, the callose synthase BdGSL2 was identified among 11 putative callose synthases as a putative functional homolog of AtGSL5.