Untersuchungen zur Regulation und Konservierung imprinteter Genexpression in Angiospermen.

Abstract

Im Rahmen der Arbeit \\\"Untersuchungen zur Regulation und Konservierung imprinteter Genexpression in Angiospermen“ wurden imprintete Gene in Mais identifiziert und deren Konservierung in Angiospermen untersucht. Des Weiteren wurden Analysen zur Rolle bei Imprinting einer DNA-Glykosylase in Mais sowie Untersuchungen zur Regulation und Funktion des imprinteten Gens MEE1 durchgeführt. Zur Untersuchung der Regulation der Expression des imprinteten Gens MEE1, wurden transgene mee1 Maispflanzen generiert, deren Expression des MEE1-GFP-Fusionsproteins mithilfe des endogenen MEE1-Promotors reguliert wurde. Eine Analyse der mee1Pro:mee1:GFP Genexpression in reziproken Maiskreuzungen konnte zeigen, dass das Gen im Endosperm nicht über Imprinting reguliert wurde und folglich der verwendete genomische Kontext des Gens MEE1 nicht für eine maternale Genexpression ausreichte. Zur MEE1 Imprinting-Regulation könnten daher wie auch beim PHE1, Wechselwirkungen mit weiter entfernt liegenden genomischen Sequenzabschnitten notwendig sein. Die Dynamik der Remethylierung im Anschluss an die DNA-Replikation wurde für das imprintete Gens MEE1 in Endosperm und Embryo mittels einer Hairpin-Bisulfit-PCR untersucht. Durch Begutachtung der Methylierung der verschiedenen Cytosin-Kontexte in komplementären DNA-Strängen konnte für die paternalen Allele in Endosperm und Embryo eine höhere Hemimethylierungsrate als für die maternalen Allele im Embryo detektiert werden. Die geringere Dynamik der DNA-Methylierung der maternalen Allele im Maisembryo deutet auf eine siRNA-vermittelte DNA-Methylierung hin. In weiteren Versuchen wurde zur funktionellen Analyse des Gens MEE1 eine Überexpressionslinie in Mais und eine Insertions-Doppelmutante in Arabidopsis generiert. Für die transgene Überexpressionslinie in Mais wurde ein Expressionsverlust nach einer Generation festgestellt sowie keine GFP-Fluoreszenz detektiert. Eine de novo DNA-Methylierung am Promotor könnte zum Expressionsverlust des Konstrukts in Mais geführt haben. Für die Doppelmutanten in Arabidopsis konnten mittels mikroskopischer Analyse keine Hinweise auf eine Entwicklungsstörung des Samens aufgrund des Funktionsverlusts der orthologen MEE1 Gene nachgewiesen werden. Der fehlende Einfluss auf die Samenentwicklung könnte auf einer Kompensation der Genfunktion durch noch nicht bekannte paraloge Gene beruhen. Ein Vergleich der Proteinsequenzen ergab, dass die Gene in Mais und Arabidopsis unterschiedliche Funktionen haben könnten. Die Identifikation putativ, imprinteter Gene in Mais erfolgte über die Identifizierung syntenisch orthologer Gene aus Reis mit einer Imprinting-Regulation. Eine Imprinting-Regulation konnte für 10 orthologe Maisgene mittels allelspezifischer Expressionsanalysen in reziproken Kreuzungen bestätigt werden. Ein Vergleich der Gene mit Datensätzen aus verschiedenen Spezies ergab für mehrere Gene eine konservierte Imprinting-Regulation in monokotylen- und dikotylen-Pflanzen. Die Ergebnisse deuten auf eine höhere Anzahl konservierter, imprinteter Gene als bisher gezeigt hin. Mittels eines Expressionsatlas konnten in Mais drei grundsätzlich verschiedene Expressionstypen für die imprinteten Gene ermittelt werden. Detektierte Variationen des Imprinting-Status zwischen verschiedenen Genotypen und ein Wechsel der Expression von einem elterlichen Allel zum Anderen in verschiedenen Spezies deuten auf eine hohe evolutionäre Dynamik des Imprintings hin. Auf Basis einer RNA-Tiefensequenzierung wurden putativ imprintete Gene im Maisendosperm nachgewiesen. Mittels Untersuchungen zur allelspezifischen Expression der ausgewählten Gene konnte ein maternal imprintetes Gen im Embryo ermittelt werden. Es wurden erste Hinweise auf eine transiente Genexpression gezeigt, die in Übereinstimmung mit denen bekannter imprinteter Gene im Embryo ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass für das im Embryo imprintete Gen eine konservierte Imprinting-Regulation zwischen Mais und Arabidopsis vorliegt. Aufgrund dessen könnte das Ubiquitin codierende Gen eine wichtige Funktion zur Regulation in der Samenentwicklung ausüben. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal ein Einfluss einer DNA-Glykosylase (DNG105) auf die Imprinting-Regulation in Mais gezeigt werden. Hierzu wurden transgene DNG105 RNAi-Maispflanzen verwendet. Für das Gen MEE1 konnte keine Veränderung der Imprinting-Regulation in reziproken Kreuzungen nachgewiesen werden. Hingegen konnte für das maternale Gen FIE1 und in zwei paternal imprinteten Genen eine Aktivierung des sonst stillgelegten Allels detektiert werden. Diese Ergebnisse lassen eine indirekte Beteiligung von DNG105 an der Imprinting-Regulation über PcG-Komplexe bestimmter Gene in Mais vermuten.