Characterization of structural requirements for ER export and analysis of turnover of the Golgi-resident N-acetylglucosamin-1-phosphotransferase

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die strukturellen Vorausetzungen für den Export des PT α/β-Vorläuferproteins des hexameren, Golgi-residenten GlcNAc-1-Phosphotransferase Komplexes aus dem endoplasmatischem Reticulum (ER) untersucht. Expressionstudien, N-Glykosilierungs- und Kolokalisierungsanalysen belegen, daß das Vorläuferprotein und eine Site1-Protease Spaltungs-defiziente Mutante vom ER zum Golgi Apparat transportiert wurden, während die koexprimierten isolierten α- und β-Untereinheiten im ER zurückgehalten wurden. Diese Analysen ergaben, dass die Typ III Membrantopologie und die Dimerisierung des ungespaltenen Vorlauferproteins für den effizienten ER Export notwendig ist. Mutationsanalysen zeigten, daß beide cytosolische Domänen wichtig für den ER Export des Vorläuferproteins sind. Expressionsanalysen von Vorläuferproteinen mit mutierten potentiellen ER Export Motiven belegen, daß der ER Export durch ein kombinatorisches Sortierungssignal vermittelt wird, das aus einem N-terminalen Dileucin Signal (5LL6) und einem C-terminalen dibasischen RIR (1242RIR1244) Motiv zusammengesetzt ist. Die Lokalisation und Sequenz der identifizierten Sortierungssignale in den cytosolischen Domänen waren nicht austauschbar. Koexpressionsstudien mit einer dominant-negativen Sar1-Mutante ergaben, daß das PT α/β-Vorläuferproteins in COPIIbeschichteten Vesikeln vom ER zum Golgi Apparat transportiert wird. Expressionsanalysen von chimären Proteinen, die aus der luminalen Domäne von LIMP-2 und den cytosolischen und Transmembrandomänen der PT α/β zusammengesetzt waren, zeigten, daß die luminale PT-Domäne ebenfalls essentiell für den ER Export ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Abbauwege von Wild Typ und mutanten PT α-und β- Proteinen in kultivierten Zellen untersucht. CHX-Chase Analysen ergaben für das PT α/β Vorläuferprotein und die gespaltene β-Untereinheit Halbwertszeiten von 15 Stunden bzw. > 15 Stunden. Expressionsanalysen in Anwesenheit von proteasomalen und lysosomalen Inhibitoren zeigten, dass die Wildtyp α- and β-Untereinheiten der PT durch lysosomale Cystein-Proteasen in sauren Kompartimenten abgebaut werden. Expressionsanalysen der mutierten PT-K4Q und -S399F Vorläuferproteine, die bei Patienten mit Mukolipidose Typ III alpha/beta identifiziert wurden, zeigten stark verminderte Halbwertszeiten im Vergleich zum Wild Typ Protein. Verminderter ER Export (S399F, K4Q), ER-assoziierter Abbau der Vorläuferproteine im Proteasom (S399F, K4Q) und erhöhter lysosomaler Abbau (K4Q) führten zur Verminderung gespaltener, katalytisch aktiver α- and β-Untereinheiten im Golgi Apparat. Die Untersuchungen zeigten, dass Mutationen in der α-Untereinheit der PT (K4Q) zum gesteigerten lysosomalen Abbau der β-Untereinheiten und möglicherweise des gesamten hexameren PT-Komplexes führen. Biotinylierungsexperimente und Analyse gespaltener α- and β-Untereinheiten der PT im Medium zeigten, dass der Transport an die Plasmamembran und die Sekretion löslicher Formen ins Medium nicht zum Abbau von Wild Typ und mutanten (K4Q) α and β-Untereinheiten der PT beitragen. Bei einer weiteren MLIII alpha/beta Mutation K1236M, die in der C-terminalen cytsoslischen Domäne lokalisiert ist, waren weder der ER Export gehemmt noch der Abbau im Proteasom/Lysosom erhöht. Durch silencing RNA-vermittelte Herunterregulierung von 200 Genen, die für Proteine des endoplasmatischen Reticulums, des Golgi Apparats und cytosolischer Proteine kodieren, wurde Proteine identifiziert, die für die Phosphorylierung von Mannoseresten und/oder den intrazellulären Transport neusynthetisierter löslicher lysosomaler Enzyme wichtig sind. Die Daten unterstreichen die Bedeutung von Golgi-lokalisierten Tethering Komplexen, wie SNARE-, GARP- and COG-Komplexen, für die Mannose 6-Phosphat Biosynthese an löslichen lysosomalen Enzymen und den intrazellulären Transport der Mannose 6- Phosphat Rezeptoren.

In the present study structural requirements for efficient ER export of the PT α/β-subunit precursor protein were analyzed. Expression analyses and co-localization studies showed that both wild type and a cleavage-resistant PT α/β-subunit precursor protein were exported from the ER, whereas coexpressed separate α- and β-subunits failed to reach the Golgi indicating that the presence of type III membrane topology is required for ER exit. Mutational analyses revealed that both the N- and C-terminal cytosolic tails are critical for ER export. Alanine scanning analyses of putative ER export signals showed that ER export of the precursor protein is mediated by a combinatorial signal composed a N-terminal dileucine signal (5LL6) and a C-terminal dibasic (R/K)X(R/K)-type RIR (1242RIR1244) motif. These sorting motifs are not interchangeable and have to be exposed in a defined orientation with respect to the TMDs to be recognized by the COPII machinery. In the presence of a dominant-negative Sar1 mutant, ER exit of the precursor protein was inhibited indicating its transport via COPII-coated vesicles. In addition, expression analyses of PT-LIMP-2 chimera revealed that the presence of the dimerized, highly glycosylated LD of the PT α/β-subunit precursor protein is critically required for ER export, whereas the TMDs are not important. In the second part of the study the turnover of wild type and mutant precursor and mature PT α- and β-subunits were studied. CHX-chase analyses revealed an approximate half-life time of 15 h for the precursor protein and of > 15 h for the mature β-subunit. Expression analyses in the presence of proteasomal and lysosomal protease inhibitors showed that both wild type and mutant PT complexes containing mature, cleaved α- and β-subunits are degraded in lysosomal compartments. Transport to the plasma membrane and shedding into the medium did not contribute to the turnover of wild type PT α and β-subunits. Expression analyses of MLIII mutant precursor proteins revealed that both impaired ER export and increased turnover in lysosomes contribute to reduced amounts of catalytically active PT α- and β-subunits. Mutation S399F located in the LD led to ER retention and ERassociated degradation of the mutant precursor protein. Mutation K4Q in the cytosolic domain resulted in impaired ER export of the mutant precursor protein and rapid degradation of the residual PT β-subunit in lysosomes. Mutation K1236M did not impair ER export of the precursor and stability of the cleaved PT β-subunit. Mechanisms contributing to decreased enzymatic activity of mutant K1236M remain to be investigated. siRNA-mediated downregulation of genes coding for ER and Golgi-resident and associated proteins identified several genes required for M6P-biosynthesis, MPR-receptor trafficking and intra-Golgi transport. Downregulation of subunits of Golgi-localized SNARES, the GARP and COG-complexes resulted in increased β-hex secretion into the medium. The specific role of these genes for the catalytic activity of the PT α- and β-subunits and MPR trafficking remains to be investigated. The data stress the importance of Golgi-localized tethering complexes for M6P-biosynthesis and MPR-mediated sorting of lysosomal proteins.