Immuncytochemischer Nachweis residueller Doppelstrangbrüche zur Bestimmung der zellulären Strahlenempfindlichkeit unter Berücksichtigung der Chromatinstruktur bei humanen Fibroblasten

Abstract

Von maßgeblicher Bedeutung für die individuelle Strahlenempfindlichkeit ist die Effektivität der zellulären Reparaturprozesse von DNA-Schäden. Hierbei wird aktuell der Chromatinstruktur besondere Bedeutung beigemessen, da das kompakte Heterochromatin im Gegensatz zu dem locker organisierten Euchromatin die DNA-Reparatur möglicherweise behindert und somit als morphologischer Hinweis auf eine verminderte DNA-Reparatur diskutiert wird. Bezüglich der Bestimmung der zellulären Strahlenempfindlichkeit steht eine Reihe von Methoden zur Verfügung. Zum einen wird der in der Strahlenbiologie als Goldstandard geltende in-vitro-Kolonietest, mit dessen Hilfe das zelluläre Überleben nach Bestrahlung quantifiziert werden kann, angewendet. Zum anderen steht seit einigen Jahren mit dem Nachweis sogenannter Ionizing Radiation-induced Foci (IRIF) eine Methode zur Verfügung, residuelle DNA-Schädigungen als lokale Ereignisse darzustellen und zu quantifizieren. Diese Methode erfährt durch die Verfügbarkeit neuer Antikörper zum Nachweis verschiedener reparatur-assoziierter Proteine kontinuierliche Optimierung. Ziel dieser Arbeit war die Optimierung des Nachweises residueller DNA-Schäden unter Verwendung spezifischer Antikörper gegen die reparaturassoziierten Proteine γH2AX, 53BP1 und den neuerdings kommerziell erwerbbaren Antikörper gegen pATM. Neben den methodischen Aspekten wurde darüber hinaus die Bedeutung der Chromatinstruktur für die zelluläre Strahlenempfindlichkeit untersucht. Ziel war die Klärung der Fragestellung, ob ein Zusammenhang zwischen dem Anteil an Heterochromatin und der zellulären Strahlenempfindlichkeit besteht. Außerdem sollte die Hypothese, dass Heterochromatin eine Barriere für die DNAReparatur darstellt und folglich residuelle Doppelstrangbrüche vorzugsweise im Heterochromatin lokalisiert sind, überprüft werden. Als methodische Voraussetzung galt es zunächst, den immuncytochemischen Heterochromatin-Nachweis zu implementieren sowie eine Methode der Quantifizierung des Heterochromatinanteils zu entwickeln und geeignete Parameter zur Charakterisierung des Heterochromatin-Status zu identifizieren.