A novel function-based screen for detecting RubisCO active clones from metagenomic libraries : elucidating the role of RubisCO associated enzymes.

Abstract

Das Enzym Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RubisCO; EC 4.1.1.39) katalysiert die Schlüsselreaktion des Calvin Benson (CB) Zyklus, eine Reaktion bei dem erstmalig im Ablauf des Zyklus Kohlenstoff fixiert wird. Dieses einzigartige Enzym kommt in allen Pflanzen, Cyanobakterien und vielen autotrophen Bakterien vor (phototrophe und chemotrophe Prokaryoten) und fast der gesamte, weltweit durch Primärproduzenten assimilierte anorganische Kohlenstoff kann auf die Aktivität der RubisCO zurückgeführt werden (>99.5%). Die meisten Studien die das Wissen um die Funktionsweise der RubisCO erweitert haben, wurden mit Pflanzen oder kultivierbaren Mikroorganismen durchgeführt. Die Funktionalität von RubisCO Enzymen aus der Umwelt sowie die Bedeutung flankierender Genregionen ist jedoch noch immer ungeklärt. Derzeit gibt es keinen funktionsbasierten Ansatz, der es ermöglicht RubisCO aktive Enzyme direkt aus der Umwelt zu isolieren. Die Mehrheit funktionsfähiger RubisCOs und RubisCO assoziierter Gene unkultivierter Mikroorganismen (>99%) bleibt folglich unzugänglich. In dieser Studie wird erstmals ein funktionsbasierter Ansatz vorgestellt, der es ermöglicht Metagenombanken nach Klonen mit RubisCO-Aktivität zu durchsuchen und dementsprechend RubisCOs direkt in Umweltproben zu detektieren. Unter Anwendung des neu etablierten Durchmusterungsverfahrens wurden insgesamt zwölf RubisCO aktive Klone identifiziert, die sequenzielle Übereinstimmungen zu Thiomicrospira crunogena aufwiesen. Die 35.2 kb umfassenden metagenomischen DNA Fragmente bestehen aus einem RubisCO Gen Cluster und flankierender DNA. Des Weiteren wurde die Bedeutung der auf dem metagenomischen DNA Fragment kodierten Genen in Bezug auf die Expression einer voll funktionsfähigen RubisCO analysiert, indem einzelne Gene durch Transposon Insertionen ausgeschalten wurden. Hier wurde unter anderem ein Gen detektiert (orf06), das für ein hypothetisches Protein kodiert das niemals zuvor mit der Funktionsfähigkeit des RubisCO Enzyms in Verbindung gebracht wurde, jedoch direkt oder indirekt die Transkription sowohl von cbbL als auch von cbbM aktivierend reguliert. Signifikant veränderte RubisCO Aktivitäten wurden darüber hinaus für elf weitere ausgeschaltene Gene gemessen, die entweder für Proteine kodieren die als transkriptionelle Regulatoren annotiert sind oder für Proteine von den angenommen wird, dass sie an der RubisCO Aktivierung beteiligt sind. Mit diesem Screening Verfahren ist es nun möglich RubisCOs von bisher unkultivierten Mikroorganismen zu detektieren und deren Funktionsweise zu analysieren.

Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO; EC 4.1.1.39) catalyzes the key and primary carbon fixation reaction of the Calvin Benson cycle (CB cycle). This unique enzyme is present in all plants, cyanobacteria and most autotrophic bacteria (phototrophs and chemolitoautotrophs) and is involved in the assimilation of most of the inorganic carbon fixed by all primary producers on Earth (>99.5%). Most studies that have enhanced our understanding of RubisCO functioning have been conducted with plants or cultured bacteria. The functionality of environmental RubisCOs as well as the importance of gene products encoded on flanking DNA regions is however still enigmatic. Currently no sequence independent approach is available, that enables seeking of RubisCOs directly from the environment by functionality alone. Therefore, the vast majority of functional RubisCOs and RubisCO associated genes from uncultured organisms (>99%) remains inaccessible. This study describes a novel, function-based approach suited to seek RubisCO active enzymes directly from metagenomic libraries. Within this study twelve environmental, recombinant RubisCOs were identified through this screen and resembled genes form Thiomicrospira crunogena. The 35.2 kb comprising metagenomic fragments consist of a RubisCO gene cluster and flanking DNA regions. The relevance of potential RubisCO associated genes for expressing a fully functional RubisCO was further investigated for one clone exemplarily, by making single genes inoperative due to transposon insertions. This approach uncovered one gene (orf06) whose gene product has never been associated with RubisCO activity before, but is directly or indirectly involved in positively regulating the transcription of cbbM and cbbL. Significantly changed RubisCO activities were furthermore found for clones with insertions in eleven other genes, whose gene products were assigned to functions of putative transcriptional regulators or those believed to be vital for RubisCO activation. This screen opens the door to detect up until now unexplored RubisCOs from the otherwise inaccessible uncultured majority and enables us to better understand the functioning of prokaryotic RubisCOs.