Adhäsion von Plasmodium falciparum (Welch, 1897) infizierten Erythrozyten an den humanen Endothelrezeptor P-Selektin : Charakterisierung der Bindungseigenschaften auf biochemischer Ebene

Abstract

Die Pathogenität des Malariaerregers P. falciparum beruht unter anderem auf der Zytoadhärenz von P. falciparum infizierten Erythrozyten an Endothelzellen des Wirtes. Diese sogenannte Sequestrierung, erlaubt dem Parasiten der Milzpassage und der dortigen Erkennung und Eliminierung zu entgehen. Bislang konnten 22 Endothelrezeptoren und Liganden beschrieben werden, die an der Bindung infizierter Erythrozyten beteiligt sind. Es wird angenommen, dass infizierte Erythrozyten synergistisch mit unterschiedlichen Adhäsionsmolekülen interagieren, um trotz der hohen Fließgeschwindigkeiten des Blutes eine effiziente Bindung an die Endothelzellen zu etablieren. Infizierte Erythrozyten gelangen zu den Endothelzellen und können dort mit Rezeptoren wie ICAM-1, VCAM-1 und P-Selektin interagieren. Durch eine schwache Bindung wird die Geschwindigkeit der infizierten Erythrozyten herabgesetzt, was zu einem Rollen der infizierten Erythrozyten über die Endothelzellen und einer weiteren Abnahme an Geschwindigkeit führt. Dies ermöglicht eine stabile Bindung an dem nahezu ubiquitär verbreiteten Rezeptor CD36. Auf Seiten des Parasiten konnten als Liganden Mitglieder einer großen Familie variabler Adhäsionsproteine, die PfEMP1 (Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1) Proteine, für die Interaktion mit einigen Rezeptoren identifiziert werden. PfEMP1 Proteine sind bekannte Pathogenitätsfaktoren, die auf der Oberfläche infizierter Erythrozyten lokalisiert sind und von der var-Genfamilie kodiert werden. Abhängig von der Lokalisation auf dem Chromosom, der Transkriptionsrichtung sowie der Zusammensetzung der Protein-Domänen ist eine Klassifizierung in verschiedene Gruppen möglich. Ziel dieser Arbeit war es, durch vergleichende Transkriptom-Analysen den bislang unbekannten Liganden für den Endothelrezeptor P-Selektin zu identifizieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden Parasitenpopulationen genutzt, die zuvor bezüglich der Bindung an P-Selektin angereichert wurden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zunächst die optimalen Bedingungen für die sich anschließenden Bindungsexperimente mit dem Endothelrezeptor P-Selektin bestimmt. Zeitgleich wurde mithilfe sechs weiterer Endothelrezeptoren untersucht, ob die Bindungskapazität von verschiedenen Laborstämmen variiert und möglicherweise mit der Kultivierungsart oder der Formation sogenannter Knobs (Ausstülpungen auf der Oberfläche infizierter Erythrozyten) korreliert. Dabei konnte keine Korrelation zwischen der Bindungsfähigkeit und der Bildung von Knobs (mit Ausnahme des Rezeptors ICAM-1), wohl aber dem verwendeten Laborstamm sowie der Art der Kultivierung gefunden werden. Dabei zeigte sich, dass die stärkste Bindung fast aller Rezeptoren beim mit humanem Serum kultivierten Laborstamm FCR3 zu beobachten ist. Weitere vergleichende Analysen der unterschiedlich kultivierten Laborstämme zeigten Varianzen in der Größe der Knobs, dem Transkriptionsprofil und der Lokalisation verschiedener Mitglieder der variablen Oberflächenproteine (variant surface antigens) von P. falciparum. Allerdings konnte für keinen der gefundenen Unterschiede eine Korrelation zu der Bindung an Endothelrezeptoren gefunden werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden vergleichende Transkriptom-Analysen mithilfe angereicherter Parasitenpopulationen durchgeführt, wobei die Anreicherung durch Bindung an den Rezeptor P-Selektin erfolgte. Hier konnte erstmals ein var-Gen, it4_var2, identifiziert werden, das exklusiv in der angereicherten Kultur exprimiert wird und somit ein potentieller Ligand für P-Selektin ist. Das entsprechende PfEMP1 Protein (IT4_var2) wird in eine Proteingruppe eingeordnet, die mit schwerer Malaria assoziiert und auch als Interaktionspartner für den Rezeptor PECAM-1 beschrieben ist. Neben it4_var2 wurde auch ein weiteres Gen (PFIT_0406300) identifiziert, dessen Expression in P-Selektin angereicherten Parasiten verstärkt ist. Es kann allerdings keine Aussage darüber getroffen werden, ob und welche Rolle das entsprechende Protein bei der Bindung an P-Selektin übernimmt.

The virulence of the human pathogen Plasmodium falciparum, responsible for the severe falciparum malaria, is based on the ability of infected red blood cells (iRBC) to adhere to endothelial host cells. This sequestration enables the parasite to avoid the passage through the spleen, recognition and subsequent killing. So far 22 endothelial receptors or ligands are known, for which an interaction with iRBC occurs. In this context it is suggested that iRBC synergistically interact with various adhesion molecules to establish an efficient binding to endothelial cells in spite of the physiological flow. In a first step, iRBC are recruited to the endothelium where they interact with receptors like ICAM-1, VCAM-1, and P-selectin by a weak bond. As a result the iRBC slow down their speed and begin to roll over the endothelial cells which reduces their speed additionally. This finally leads to a firm adhesion to the almost ubiquitous receptor CD36. Members of the clonally variant PfEMP1 (Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1) protein family are parasitic proteins that mediate the binding to the different host cell receptors. These proteins are known virulence factors which are expressed on the surface of infected erythrocytes and are encoded by the var genes. With regard to their chromosomal localization, the direction of transcription as well as of the composition of the protein domains, the PfEMP1 members can be classified into different groups. According to this knowledge the aim of this work was to identify the unknown ligand (of parasitic origin) for the receptor P-selectin by comparative transcriptome analysis. To achieve this object parasites were enriched concerning their binding to P-selectin. In the first part of this work the optimal conditions for the following binding experiments with P-selectin were determined. Simultaneously, it was investigated by the use of six additional receptors whether there is a correlation between binding capacity and used laboratory strain, cultivation and/or the formation of the so called knobs (small protrusions on the surface of iRBC). No correlation could be detected between the binding phenotype and the formation of knobs (except for the receptor ICAM-1). Nevertheless, it could be shown that the binding capacity depends on the used laboratory strain as well as on the kind of cultivation. The most efficient binding for almost all analyzed receptors were detected by using laboratory strain FCR3, cultivated with human serum. Furthermore, comparative studies of the different laboratory strains showed a variation in knob dimension, in the transcription profil and in the localization of diverse members of the variable surface antigens of P. falciparum. However, a correlation between these differences and the adhesion to endothelial cells was not found. In the second part of the work comparative transcriptome analysis were conducted with enriched P. falciparum populations, whereby the enrichment was achieved by binding to the receptor P-selectin. Here, one var-gene, it4_var2, could be identified to be expressed exclusively in the enriched parasites and is therefore a potential ligand for P-selectin. The PfEMP1 protein (IT4_var2) is classified into a PfEMP1 group which is associated with severe malaria and recently it was identified as an interaction partner of the endothelial receptor PECAM-1. Besides it4_var2 another gene (PFIT_0406300) could be identified showing enhanced expression in parasites which were enriched for binding to P-selectin. So far, it is not known if the corresponding protein is involved in the interaction with P-selectin.