Kardiale Gewebeersatztherapie mittels künstlichem Herzgewebe aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, effiziente Protokolle zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs) zu Kardiomyozyten und Endothelzellen zu etablieren, um danach aus diesen EHTs zu generieren. Anschließend erfolgte die Evaluation dieser EHTs aus humanen Kardiomyozyten und Endothelzellen als Gewebeersatz in einem Kleintiermodell, um langfristig eine klinische Anwendung als Therapieoption für infarziertes Myokard zu entwickeln. In dieser Studie sollte insbesondere untersucht werden, ob die EHTs die Transplantation auf das infarzierte Myokard überleben, ob die Transplantation die linksventrikuläre Funktion verbessert und ob die humanen EHTs elektrisch an das Empfängermyokard koppeln können.

Durch Optimierung und Standardisierung der kardialen Differenzierung von hiPSC gelang es ein Protokoll zu etablieren, mit dem Differenzierungseffizienzen von bis zu 90% erreicht wurden. Die Differenzierung basierte auf der Bildung von Embryoid bodies (EBs) in Spinner Flaschen, wodurch Zelllinien-unabhängig große Mengen an EBs einheitlicher Qualität hergestellt werden konnten. In weiteren Schritten erfolgte die Induktion von mesodermalen Progenitorzellen mit der Kombination der Wachstumsfaktoren BMP4, Activin A und bFGF. Die Differenzierung von spontan schlagenden Kardiomyozyten erfolgte durch den kleinmolekularen Wnt-Signalweginhibitor DS-I-7.

Des Weiteren konnte ein Protokoll etabliert werden, um Endothelzellen aus hiPSCs zu differenzieren. Dieses beruht in Analogie zu dem etablierten Protokoll zur kardialen Differenzierung auf der Induktion von mesodermalen Progenitoren und der anschließenden Differenzierung zu Endothelzellen mit den Wachstumsfaktoren bFGF und VEGF. Die Differenzierungseffizienz lag bei etwa 20%. Zur Anreicherung CD31 positiver Zellen wurde eine zweistufige MACS-Aufreinigung optimiert, wodurch reproduzierbar Endothelzellen mit >95% Reinheit generiert wurden. Im Matrigel™-tube-formation-assay bildeten diese Endothelzellen Gefäße aus. Als Transplantat wurden 2-Post EHTs im 6-Vertiefungen Format mit jeweils 5 Millionen hiPS-Kardiomyozyten und 2 Millionen HUVECs/hiPS-Endothelzellen generiert. Diese zeigten nach zwei Wochen in Kultur kohärente Kontraktionen des gesamten EHTs.

Für die Transplantationsstudie wurde der linke Ventrikel von Meerschweinchen mit einem Kryo-Stempel verletzt. Eine Woche nach Verletzung des linken Ventrikels erfolgte die Transplantation von zwei EHTs, bzw. eines zellfreien Konstruktes in der Kontrollgruppe. Der Erfolg der Transplantationen wurde 28 Tage später histologisch und echokardiographisch verifiziert. Hierbei zeigte sich, dass hiPSC-EHTs eine Transplantation auf das verletzte Myokard überleben und neues humanes Myokard im Narbengewebe entsteht. Histologisch zeigten sich Inseln (100-800 µm im Durchmesser und bis zu 2 mm in der Länge) von humanem Herzmuskelgewebe im Narbengewebe. Diese Zellen waren quergestreift und exprimierten die ventrikuläre Isoform der Myosin-Leichtkette. Der humane Ursprung dieser Zellen wurde durch eine Fluorescent-in-situ-Hybridisierung (FISH) gegen das humane Zentromer 17 nachgewiesen. Die implantierten EHTs wurden von Gefäßen des Wirtes vaskularisiert, und es konnten in einem relativ hohen Prozentsatz proliferierende humane Kardiomyozyten (17% Ki67-positiv) nachgewiesen werden.

Die linksventrikuläre Funktion wurde vor Kryo-Verletzung, sieben Tage nach Verletzung (vor Transplantation) und 28 Tage nach Transplantation mittels Echokardiographie untersucht. Die Transplantation von humanen EHTs führte sowohl im Vergleich zur Kontrollgruppe, als auch zur Ausgangslage vor Transplantation zu einer signifikanten Verbesserung der linksventrikulären Funktion (fraktionelle Verkürzungsfraktion 38,0±13,2% vs. 23,8±7,2% vor Transplantation), während zellfreie Konstrukte keinen Effekt hatten (24,3±12,4% vs. 23,8±7,2% vor Transplantation). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass hiPSC-abgeleitete Fibrin-EHTs in einem Meerschweinchen Kryoinfarktmodell zu einer teilweisen Re-Muskularisierung und einer signifikanten Verbesserung der linksventrikulären Herzfunktion führen. Sie ist damit die erste proof-of-concept Studie für einen humanen Tissue Engineering Ansatz in einem nicht-Nager Tiermodell.

The aim of this study was to establish efficient protocols to differentiate human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to cardiomyocytes and endothelial cells, to subsequently generate EHTs. Afterwards, the EHTs from human cardiomyocytes and endothelial cells were evaluated in a small animal model to develop a tissue replacement for clinical application in a long term. In particular it was examined whether the EHTs survive after transplantation onto the infarcted myocardium, if the left ventricular function is improved after transplantation and whether the human EHTs couple electrically to the host myocardium.

Optimization and standardization led to a cardiac differentiation protocol, which resulted in differentiation efficiencies of up to 90%. The differentiation was based on embryoid body (EB) formation in spinner flasks, cell line independently leading to large quantities of EBs of uniform quality. In further steps the induction of mesodermal progenitor cells was induced by the growth factors BMP4, Activin A and bFGF. The differentiation of spontaneously contracting cardiomyocytes was initiated by the small-molecule Wnt-signalling inhibitor DS I 7.

Furthermore, a protocol was established to differentiate endothelial cells from hiPSCs. In analogy to the established cardiac differentiation protocol, the principle is to induce mesodermal progenitor cells and subsequently differentiate endothelial cells with the growth factors bFGF and VEGF. Differentiation efficiency was about 20%. To enrich CD31- positive cells, a two-step MACS purification has been optimized and endothelial cells were reproducibly generated with >95% purity. In a Matrigel™ tube-formation assay these endothelial cells were able to form tubes.

As a transplant, 2-Post EHTs were generated in a 6-well format, each containing 5 million hiPS-cardiomyocytes and 2 million HUVECs/ hiPS-endothelial cells. After two weeks in culture, they showed coherent contractions of the entire EHT.

For the transplantation study, the left ventricle of guinea pigs was injured with a cryo-probe. One week after injuring the left ventricle, either two EHTs or a cell-free construct in the control group were transplanted onto the injured heart. The success of the transplantation was verified histologically and echocardiographically four weeks later. The results showed that hiPSC-EHTs survived the transplantation onto the injured myocardium and that novel human myocardium was formed in the scar area. Histological examination showed islands (100-800 microns in diameter and up to 2 mm in length) of human heart muscle in the scar tissue. These cells were cross-striated and expressed the ventricular isoform of myosin light chain. The human origin of these cells was confirmed by fluorescent-in-situ-hybridization (FISH) against human centromere 17. The implanted EHTs were vascularized by vessels of the host and showed proliferating human cardiomyocytes at a relatively high frequency (17% Ki67 positive cells).

Left ventricular function was examined before cryo-injury, seven days after injury (before transplantation) and four weeks after transplantation by echocardiography. The transplantation of human EHTs resulted in a significant improvement of left ventricular function both compared to control and pre-transplantation function (fractional area shortening 38.0±13.2% vs. 23.8±7.2% before transplantation), whereas cell-free constructs had no effect (24.3±12.4% vs. 23.8±7.2% % before transplantation).

This work showed that hiPSC-derived human EHTs lead to partial remuscularization and significant improvement of the left ventricular function of cryo-injured guinea-pig hearts. The study is the first to provide proof of concept for cardiac repair by an engineered human heart construct in a non-rodent animal model.