Scale-up – Generierung künstlicher Herzgewebe (engineered heart tissue, EHT) im Maßstab eines Transplantats für Menschen

Abstract

Künstliche Herzmuskelgewebe (engineered heart tissue, EHT) dienten bisher in der Grundlagenforschung der Aufklärung zellulärer Mechanismen, der Krankheitsmodellierung und der in-vitro-Testung von Pharmaka. Das ultimative klinische Ziel der EHT-Forschung auf Basis von Hydrogelen ist ihre Anwendung in der Gewebeersatztherapie in Form von Patches bei Postmyokardinfarkt-Patienten. Eine aktuelle Hürde stellt dabei die Größe der EHTs dar. Dies ist wahrscheinlich zum großen Teil auf Limitationen in der Nähr- und Sauerstoffversorgung größerer EHTs zurückzuführen. Beim Upscaling kommt es bei den EHTs zum vermehrten Zellabsterben während der Kulturzeit, da die Nähr- und Sauerstoffversorgung der EHTs auf Diffusion besteht. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung großer EHTs, möglichst im cm2-Format, die makroskopisch kontrahieren und histologisch ein höheres Zellüberleben und eine bessere Zellverteilung entlang des gesamten EHT-Querschnitts vorweisen. Durch diese Arbeit konnte ein Protokoll zur Herstellung von großen EHTs im 6- und 1-well-Format erarbeitet werden, die makroskopisch kontrahieren. Hierfür wurden Poren unter Zuhilfenahme von biokompatiblen Schablonen aus Agarose, Gelatine PDMS und PTFE in die EHTs generiert. Die Poren in den EHTs beeinflussen durch eine bessere Nähr- und Sauerstoffversorgung und veränderte Kraftlinien die Zellstruktur im Inneren der Gewebe. Während bei Kontroll-EHTs im inneren Gewebe kaum Kardiomyozyten detektiert wurden, konnten durch den Einbau von Poren entlang des gesamten EHT-Querschnitts mehr Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Eine histologische Zellzählung zeigte ein höheres Zellüberleben in der Interventionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die DNABestimmungen bestätigten die Ergebnisse der Zellzählung. Auf Transkriptionsebene wiederum zeigten RNA-Untersuchungen keine Unterschiede auf. Durch die Kraftmessung mithilfe der Software ImageJ und der Überlistung des video-optischen Analyse-Messgeräts konnten zwei einfache und sterile Methoden der Kontraktionskraftmessung an großen EHTs (6w6p-Format) etabliert werden. Die Kontraktionsmessungen zeigten, dass die Poren-EHTs signifikant stärker kontrahierten als die Kontroll-EHTs. Zusammenfassend konnte erstmals eine Methode zur Herstellung großer, makroskopisch kontrahierender EHTs mit einer histologisch verbesserten Zellverteilung entlang des gesamten EHTs vorgestellt werden, die eine bedeutende Limitation der kardialen Gewebeersatztherapie mithilfe von Patches aufhebt. Die Übertragung der Methode auf humane EHTs mithilfe von iPSC-basierten Kardiomyozyten und darauffolgende Transplantationsstudien am Tiermodell stellen hieran anschließende Projekte dar.

Engineered heart tissues (EHT) are hydrogel-based cardiac tissues that are attached to posts of a silicone rack. In vitro they are used as screening platforms for disease modelling and preclinical drug safety screenings. The ultimate clinical aim of the EHT-research is to use the hydrogel-based-EHTs in vivo as cardiac tissue replacement on injured human hearts. A major challenge in using the EHTs in cardiac tissue replacement in humans is the size of the EHTs. Since the EHTs are not vascularized, the oxygen and nutrient supply in EHTs are based on diffusion especially during cell-culture. Due to diffusion limitations bigger tissues receive insufficient oxygen and nutrients which results in increased cell-death and a very poor contractility. The objective of this project was to generate macroscopically contracting big EHTs - preferably in cm2-format- with an increased cellsurvival throughout the whole EHT in order to improve the contractility of the EHTs. In order to do so we decided to generate pores in our EHTs referring to the mesh technique of Bian et al. (2014). Thereby we expected an improved oxygen and nutrient supply resulting in a good cellsurvival/-distribution and increased contractile function. For our upscaling project we used biocompatible templates from agarose, gelatin, PDMS and PTFE to generate pores in our EHTs. Generation of pores within the EHTs increased cellsurvival and therefore contractility of the tissue. The mechanism behind this is likely a combination of improved oxygen/nutrient supply and ultrastructural force lines introduced by the pores. While in control-EHTs only a few cells could be detected in the middle layers of the EHT, we could show histologically by a cell-counting procedure more cell survival due to all cell-layers of the porous EHTs. The Force measurements via ImageJ and via a video-optical analysis system could show two easy methods of force-measurements on bigger EHTs. Those measurements showed a significant higher force development in porous EHTs compared to the control-group. To sum up, here we present a method of generating bigger, macroscopically contracting EHTs with an improved cell-distribution throughout the whole EHT. This method obviously solves one of the important bottlenecks of EHT-Upscaling. The technique of pore formation can now be applied to larger EHTs and tested with hiPSC-derived cardiomyocytes for implantation studies.