Early life impairment of thymus function : Effects on the developing immune system

Abstract

The prevalence of immune-mediated diseases in industrial countries is rapidly increasing. Our genome has not fundamentally changed in the last decades, but our lifestyle, diet and exposure to environmental factors has changed dramatically. Therefore, it is conceivable that the increase in autoimmune diseases and allergies is most likely triggered by a combination of interventional, environmental and genomic factors. T cells play a central role in adaptive immune responses. They develop in the thymus, where precisely orchestrated processes generate an extensive repertoire of functional T cells and eliminate potential autoreactive cells. We hypothesize that thymic reduction in early life may be involved in the development of immune disorders. A premature reduction in thymus function reduces the diversity of the T cell pool. In addition, altered selection processes might lead to thymic egress of autoreactive cells. Both aspects increase the risk of immune-mediated diseases and autoimmunity. In this context, I investigated the effects of extrinsic (prenatal steroid treatment or early life thymectomy) and intrinsic (DiGeorge syndrome) factors related to thymic reduction in early childhood on the development of the immune system, particularly T cells. To study the role of the thymus on the immune composition in blood, I have established a comprehensive multicolor flow cytometry approach covering the innate and adaptive immune system. Using the t-distributed stochastic neighbor embedding algorithm, we generated a unique “immune signature” for each donor. This immune signature reflects 141 immune subpopulations, including 104 subpopulations of T cells, but also B cells, cells of the innate immune system, and recently described immune cell populations, such as innate lymphoid cells. We explored age-related changes in the innate and adaptive immune compartments of healthy donors and showed the progression of the T cell compartment with age. Using this detailed analysis of blood immune cells, particularly of T cells, we compared the immune signature of children with thymic reduction to healthy controls. We found that prenatal steroid treatment – routinely given to women at risk of preterm delivery to promote fetal lung maturation – caused an interruption of the human fetal thymic growth for six weeks, and transiently altered the thymic expression of genes important for thymus structure and negative selection of thymocytes in a murine model. Furthermore, we observed a short-term increase in the frequency of regulatory T cells and TCRVd2 cells in in cord blood of preterm neonates prenatally treated with steroids. In addition, we found an increased production of IL-2 and IL-8 by T cells after in vitro stimulation. We found no long lasting changes in prenatal steroid treatment on the immune composition in blood, however, children who had received prenatal steroids showed a trend towards a higher risk of developing immunological diseases. Permanent thymic reduction caused by early life thymectomy – as a side effect of corrective heart surgery - or DiGeorge syndrome – caused by a chromosomal microdeletion – resulted in a premature aging of the T cell compartment. This was characterized by low frequencies of recent thymic emigrants and a predominance of the memory phenotype. Interestingly, in children who underwent early life thymectomy, we found mild alterations of the T cell compartment already at time of surgery. In addition to the prematurely aged T cell compartment, our data indicated that high CD39 expression, particularly on Tregs, and an increased frequency of virtual memory cells might be promising diagnostic markers for early detection of immune deficiency in infancy. Finally, I could show that a combination of prenatal steroid treatment, early thymectomy and/or DiGeorge syndrome accelerated changes in the T cell compartment. In conclusion, in this thesis I showed that early life disturbances of the thymus function such as prenatal steroids and early life thymectomy, as well as thymic hypoplasia associated with DiGeorge syndrome, result in changes in the progression and composition of the immune system that might promote the development of immune-related diseases in later life. We found promising diagnostic markers for the identification of children with immune deficiency. The routine practice of prenatal steroid treatment and early life thymectomy during the last thirty years may represent a burden for future generations. The results of this thesis and future studies call for further studies to develop awareness of the possible long-term consequences of prenatal steroid treatment and early life thymectomy and suggest the revision of clinical guidelines.

Die Prävalenz von immunologischen Erkrankungen in den Industrieländern hat rasant zugenommen. Unser Genom hat sich in den letzten Jahrzehnten nicht grundlegend verändert, aber unser Lebensstil, unsere Ernährung und Umweltfaktoren haben sich dramatisch gewandelt. Daher ist es denkbar, dass die Zunahme der Autoimmunerkrankungen und Allergien durch eine Kombination aus medizinischen Maßnahmen, Umwelteinflüssen und genomischen Faktoren ausgelöst wird. T-Zellen sind ein essentieller Teil der adaptiven Immunabwehr. Sie entwickeln sich im Thymus, wo präzise abgestimmte Prozesse ein umfangreiches Repertoire an funktionellen T-Zellen erzeugen und potenzielle autoreaktive Zellen eliminieren. Wir gehen davon aus, dass die frühkindliche Verkleinerung des Thymus (Atrophie oder Hypoplasie) an der Entwicklung von Immunstörungen beteiligt ist. Eine vorzeitige Verringerung der Thymusfunktion reduziert die Vielfalt des T-Zell Repertoires und veränderte Selektionsprozesse könnten zum Austritt von autoreaktiven Zellen aus dem Thymus führen. Diese beiden Aspekte erhöhen das Risiko von immunologischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen. In diesem Zusammenhang untersuchte ich die Auswirkungen von extrinsischen (pränatale Steroidbehandlung oder frühkindliche Thymektomie) und intrinsischen (DiGeorge-Syndrom) Faktoren im Zusammenhang mit frühkindlicher Atrophie oder Hypoplasie des Thymus auf die Entwicklung des Immunsystems, insbesondere der T-Zellen. Um die Rolle des Thymus auf die Zusammensetzung der Immunzellpopulationen des peripheren Blutes zu untersuchen, habe ich eine umfassende Analyse der Immunzellen mittels Durchflusszytometrie entwickelt, die sowohl Zellen des adaptiven als auch des angeborenen Immunsystems umfasst. Mit Hilfe des t-distributed stochastic neighbor embedding (tSNE) Algorithmus, erzeugten wir für jeden Spender eine einzigartige "Immunsignatur". Diese Immunsignatur spiegelt 141 Immunsubpopulationen wider, darunter 104 Subpopulationen von T-Zellen, aber auch B-Zellen, Zellen des angeborenen Immunsystems und kürzlich beschriebenen Immunzell-Populationen, wie z.B. innate lymphoide Zellen (ILC). Wir untersuchten Veränderungen in den angeborenen und adaptiven Immunzellen gesunder Spender unterschiedlichen Alters und zeigten die altersbedingte Entwicklung des T-Zell-Kompartiments. Mittels dieser detaillierten Analyse von Immunzellen, insbesondere von T-Zellen, verglichen wir die Immunsignatur von Kindern mit frühkindlicher Atrophie oder Hypoplasie des Thymus mit gesunden Kontrollen. Wir fanden heraus, dass die pränatale Steroidbehandlung - die routinemäßig bei Frauen durchgeführt wird, welche von einer Frühgeburt bedroht sind, um die fetale Lungenreifung zu fördern - eine Unterbrechung von sechs Wochen im Wachstums des fetalen Thymus verursachte. Darüber hinaus führte die Applikation von Steroiden im Mausmodel zu einer vorübergehenden Veränderung der thymischen Expression von Genen, die für die Thymusstruktur oder die negative Selektion von Thymozyten von Bedeutung sind. Wir beobachteten einen kurzfristigen Anstieg in der Häufigkeit von regulatorischen T-Zellen und TCRVd2 Zellen im Nabelschnurblut von pränatal steroidbehandelten Frühgeborenen. Darüber hinaus zeigten wir, dass die Produktion von IL-2 und IL-8 in T-Zellen nach in vitro Stimulation erhöht war. Wir fanden keine lang anhaltenden Veränderungen der pränatalen Steroidbehandlung auf die Zusammensetzung der Immunzellen im Blut, zeigten aber, dass Kinder, die pränatale Steroide erhalten hatten, möglicherweise ein höheres Risiko für die Entwicklung immunologischer Erkrankungen aufweisen. Eine permanente Reduktion des Thymus, wie dies durch eine frühkindliche Thymektomie - im Rahmen einer Herzoperation - oder durch das DiGeorge Syndrom - verursacht durch eine chromosomale Mikrodeletion - auftritt, führte zu einer vorzeitigen Alterung des T-Zell Kompartiments. Diese war gekennzeichnet durch einen geringeren Anteil an neu gebildeten T-Zellen aus dem Thymus (recent thymic emigrants), und einem überwiegenden Anteil an Gedächniszellen. Interessanterweise fanden wir bei Kindern mit frühkindlicher Thymektomie, bereits zum Zeitpunkt der Operation leichte Veränderungen im T-Zell-Kompartiment. Neben dem vorzeitig gealterten T-Zell Kompartiment zeigten unsere Daten, dass eine hohe Expression von CD39, insbesondere bei Tregs, und ein erhöhter Anteil an antigen-unerfahrenen CD8 Gedächniszellen (virtual memory cells) vielversprechende Diagnosemarker für die Erkennung von Patienten mit Immunschwäche sind. Schließlich konnte ich zeigen, dass eine Kombination aus pränataler Steroidbehandlung, frühkindlicher Thymektomie und/oder DiGeorge Syndrom die Veränderungen im T-Zell-Kompartiment beschleunigt. Zusammenfassend zeigte ich in dieser Arbeit, dass Störungen der Thymusfunktion während der frühen Kindheit, wie dies bei pränatalen Steroiden, frühkindlicher Thymektomie oder dem DiGeorge Syndrom der Fall ist, zu Veränderungen in der Entwicklung und der Zusammensetzung der Immunzellen führen und somit die Entwicklung immunologischer Erkrankungen im späteren Leben begünstigen können. Wir haben vielversprechende diagnostische Marker für die Identifizierung von Patienten mit Immunschwäche ermittelt. Die routinemäßige Praxis der pränatalen Steroidbehandlung und der frühkindlichen Thymektomie in den letzten dreißig Jahren stellt möglicherweise eine Belastung für zukünftige Generationen dar. Die Ergebnisse dieser Arbeit verlangen weitere Studien um ein Bewusstsein für die möglichen langfristigen Folgen der pränatalen Steroidbehandlung und der frühkindlichen Thymektomie zu schaffen und empfehlen eine Neubewertung der klinischen Richtlinien.