Einfluss von Hypoxie auf die O-Glykosylierung humaner Zelllinien

Abstract

Das Auftreten von hypoxischen Arealen in soliden Tumoren induziert eine Neuprogrammierung des Zellmetabolismus und Veränderungen in der Glykosylierung, welche Kennzeichen von Karzinomen und Metastasierung sind und die Therapieresistenz fördern. Ziel der Arbeit war es Hypoxie als Einflussfaktor für aberrante O-Glykosylierung, in Form des Tn-Antigens und Hyper-O-GlcNAcylierung, in humanen HEK293- und Pankreaszellen (PANC-1, HPDE) zu identifizieren und die molekularen Mechanismen dahinter zu beleuchten. Die differentielle Expression von 84 Glykosylierungsgenen mittels quantitativer PCR in HEK293-Zellen unter Normoxie und Hypoxie, hat eine globale Verminderung der Expression von Genen der O-Glykosylierung gezeigt. Unter gleichen hypoxischen Bedingungen war im Western Blot eine Tn-Antigen-Expression induzierbar, welche sich nach Reoxygenierung teilweise reversibel zeigte. Besonders relevant für die Erklärung, der im Western Blot erhöhten Expression des Tn-Antigens, war eine signifikant verminderte Genexpression von Cosmc, dem Chaperon der T-Synthase (C1GALT1). Hypoxie führte hierüber zu einer reduzierten Aktivität der T-Synthase in der Enzymaktivitätsanalyse mit folgender Expression des Tn-Antigens. Die Rolle der HIF-1α-regulierten Transkription differentieller O-Glykosylierung unter Hypoxie wurde unter Einsatz des chemischen HIF-1α-Induktors ML 228 verdeutlicht. Es zeigte sich eine Tn-Antigen-Expression und Reduktion der T-Synthase-Aktivität. Bei HIF-1α-Inhibition (Echinomycin) unter Hypoxie nahm die Tn-Antigen-Expression ab und die T-Synthase-Aktivität zu. Zytosol- und Kernfraktionsanalysen von Zelllysaten haben das unter Hypoxie exprimierte Tn-Antigen vermehrt im Zytosol lokalisiert. Es konnte gezeigt werden, dass der dort stattfindende dynamische Prozess der Protein-O-GlcNAcylierung unter Hypoxie ebenso zunimmt und im Zusammenhang mit einer veränderten O-Phosphorylierung von Signalproteinen steht. Die Einbettung der eigenen Ergebnisse in die Erkenntnisse der aktuellen Literatur deutet auf eine Interaktion zwischen O-GalNAc und O-GlcNAc im Zytosol hin, mit der Folge einer Aktivierung von onkogenen Signalwegen, wie dem PI3K/AKT/mTOR-Signalweg, und erweitert so das Verständnis der differentiellen O-Glykosylierung unter Hypoxie und dessen Auswirkung auf die Tumorgenese.

Hypoxia-induced reprogramming of energy metabolism and changes in glycosylation in solid tumours are hallmarks of cancer that promote metastasis and treatment resistance. The aim of this work was to investigate the impact of hypoxia on aberrant O-glycosylation, which is described as an increase in O-GalNAc (Tn antigen) and O-GlcNAc glycosylation in human HEK293 cells and pancreatic cell lines (PANC-1, HPDE) as well as shedding light on the underlying molecular mechanisms. The comparative analysis of 84 glycosylation-relevant genes using qPCR in HEK293 cells, under standard or hypoxia, idenfitied key enzymes of Oglycosylation as regulated. HEK293 cells in hypoxia showed the clear expression of Tn antigen and its disappearance after reoxygenation. Highly relevant for the explanation of the increased expression of Tn antigen was a significantly decreased gene expression of Cosmc, the chaperone of T-synthase (C1GALT1). Thus hypoxia led to a reduced activity of T-synthase in enzyme activity analyses with subsequent expression of Tn antigen. Interestingly, the pattern differs from engineered Cosmc deficient cells. Through the application of the chemical HIF pathway activator ML 228 and HIF pathway inhibitor Echinomycin truncated glycotype could be induced underlining the importance of the HIF-1α regulated transcription of differential glycosylation under hypoxia. It could be shown that under hypoxia the dynamic process of O-GlcNAcylation, located in the cytosol, increased as well and was related to an altered O-phosphorylation of signal proteins. Cytosol and nuclear fraction analyses derived from hypoxia treated cells mainly displayed cytosolic proteins as O-GalNAc modified. Glycosidase assays could validate specificity of the detection method used and excepts a crossreaction between the detection of O-GalNAc and O-GlcNAc. An embedding of own results in the knowledge of current literature points to a hypoxia derived interaction between O-GalNAc and O-GlcNAc leading to the activation of oncogenic signalling pathways such as PI3K/AKT/mTOR. Thus this study extends the understanding of differential O-glycosylation under hypoxia and the dependency of a tumors malignancy also on the tumor microenvironment.