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dc.contributor.advisorStreit, Wolfgang (Prof. Dr.)
dc.contributor.authorUtpatel, Christian
dc.date.accessioned2020-10-19T13:11:14Z-
dc.date.available2020-10-19T13:11:14Z-
dc.date.issued2016
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/6206-
dc.description.abstractMany pathogenic bacteria regulate their virulence factor expression by Quorum Sens-ing (QS), the cell density dependent release and perception of small diffusible mole-cules, which are called autoinducers (AI). In the opportunistic pathogenic microorgan-ism Pseudomonas aeruginosa PAO1, in which nearly 10 % of the annotated genes are involved in regulation, Quorum Sensing regulated gene expression contributes to the formation and maintenance of biofilms and their tolerance to conventional antimicrobi-als. This makes it a promising target for infection control. Earlier it was shown that the enzymatic degradation of AI molecules is an efficient approach to control virulence of Pseudomonas. Acylases, lactonases and oxidoreductases are now known to cleave or modify the AI and thereby prevent activation of QS and in succession the controlled phenotypes like elastase, pyocyanin, hydrogen cyanide and biofilm formation. Within this framework, we have shown that the expression of a metagenome-derived short-chain dehydrogenase/reductase (SDR, BpiB09) resulted in significantly reduced pyocy-anin production, decreased motility, poor biofilm formation and decreased paralysis of nematodes. In this study and with the aim to unravel the impact on the complicated reg-ulatory system upon the expression of bpiB09, RNA sequencing (RNA-seq) was em-ployed to get detailed insight into the genetic alterations caused by BpiB09 and their impact on the bacterial metabolism. By analyzing the global transcriptome of PAO1 pBBR::bpiB09 via RNA-seq it was observed that the upregulation of the hypo-thetical protein PA2226 was not only associated with AI modification, but also with a 19 kb deletion in the bacterial chromosome. Within this thesis I could show, that the up-regulation of PA2226 was most likely responsible for several strong phenotypes con-nected to QS, including pyocyanin, elastase and 3-oxo-C12-HSL formation. For further verification of these phenotypes, several mutant strains with deletions in genes essential for QS were constructed. These strains included newly constructed lasI, rhlI and a dou-ble deletion mutant thereof as well as a mutant with a deleted PA2226. These mutations were verified by genetic complementation and PCR. Surprisingly, none of these mu-tants showed an altered biofilm phenotype compared to the parent strain. However, ∆lasI, ∆rhlI and ∆lasI/rhlI showed strong phenotypes for motility, elastase, pyocyanin and 3-oxo-C12-HSL production. With a coordinated approach of RNA-seq of a PA2226 overproducer, QS reporter gene assays in E. coli and further phenotypical testing, PA2226 was established as responsible agent and QS core mechanisms were suspect-ed as its target. The obtained RNA-seq data were in good concordance with the recent-ly defined QS core regulon of P. aeruginosa PAO1. Among the differentially expressed genes the elastase lasB, the QS regulator rsaL, the AI synthase rhlI, the genes for hy-drogen cyanide formation hcnABC and ambBCDE, which are involved in IQS for-mation, were observed. Furthermore, it became evident that the overexpression of PA2226 had a major impact on genes belonging to the functional classes of secreted factors and protein secretion/export. Additional overexpression of PA2226 in E. coli showed no activation of the included QS reporter, exposing QS active promotors and LasR as essential parts of the mode of action. After excluding the potential interference of recombinant PA2226 with QS active promotors via electrophoretic mobility shift as-says (EMSA), LasR emerged to be the most likely target. It was possible to demon-strate that PA2226’s regulatory function is closely linked to this QS response regulator by coprecipitation of recombinant PA2226 and LasR from crude cell extracts, indicating that both proteins strongly interact in P. aeruginosa. This correlates with the finding that QS phenotypes were partially rescued, when LasR and PA2226 were co-expressed, but likewise opens the possibility for at least one other interaction partner. Taking ad-vantage of next generation sequencing to analyze a PAO1 strain with strong Quorum Quenching phenotypes enabled the identification and characterization of a novel major QS regulator, extending the knowledge of the complex QS network of P. aeruginosa.en
dc.description.abstractViele pathogene Bakterien regulieren ihre Virulenz durch Quorum Sensing (QS), der zelldichteabhängigen Ausschüttung und Detektion kleiner diffusionsfähiger Moleküle, genannt Autoinducer (AI). In dem opportunistisch pathogenen Mikroorganismus Pseu-domonas aeruginosa, in welchem nahezu 10 % aller annotierter Gene in Regulations-prozessen involviert sind, trägt die Quorum Sensing regulierte Genexpression auch zur Bildung und Erhaltung von Biofilmen und der Toleranz entgegen Antibiotika bei. Dies macht es zu einem vielversprechenden Ziel zur Infektionskontrolle. Es wurde bisher gezeigt, dass der enzymatische Abbau der Autoinducermoleküle ein effizienter Ansatz zur Kontrolle der Virulenz in Pseudomonas ist. Acylasen, Laktonasen und Oxidoreduk-tasen degradieren oder modifizieren Autoinducermoleküle und verhindern damit die Aktivierung von QS und davon kontrollierten Phänotypen wie Elastase-, Pyocyanin-, Hydrogencyanid- und Biofilmbildung. In diesem Zusammenhang haben wir gezeigt, dass die Expression einer metagenomisch gewonnenen Dehydrogenase/Reduktase (BpiB09) zu signifikant reduzierter Produktion von Pyocyanin, geringer Biofilmbildung und reduzierter Paralyse von Nematoden führte. In dieser Studie wurde RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) verwendet, um den Einfluss der Expression von bpiB09 auf das komplexe regulatorische Netzwerk zu enträtseln, sowie detaillierte Einsicht in durch BpiB09 hervorgerufene genetische Modifikationen und ihren Einfluss auf den bakteriel-len Metabolismus zu bekommen. Bei der Analyse des globalen Transkriptoms von PAO1 pBBR::bpiB09 mittels RNA-Seq wurde beobachtet, dass die Hochregulierung des hypothetischen Proteins PA2226 nicht nur in Verbindung mit der Modifikation des Autoinducers steht, sondern ebenso mit einer 19 kb Deletion im bakteriellen Chromo-som. In dieser Studie konnte ich zeigen, dass die Hochregulierung von PA2226 für eini-ge starke QS Phänotypen verantwortlich ist, darunter Pyocyanin-, Elastase- und 3-oxo-C12-HSl Bildung. Zur Verifizierung dieser Phänotypen wurden eine Reihe von mutierten Stämmen generiert, welche Deletionsmutationen für essentielle QS Gene beinhalten. Diese generierten Stämme beinhalten Einzeldeletionsmutanten für lasI und rhlI, eine Doppelmutante aus diesen, sowie eine Mutante mit deletiertem PA2226. Die Mutationen wurden mittels Komplementation und PCR überprüft. Überraschenderweise zeigte kei-ne dieser Mutanten einen veränderten Biofilm Phänotyp im Vergleich zum Wildtyp. An-dererseits zeigten die Mutanten ∆lasI, ∆rhlI und ∆lasI/rhlI starke Phänotypen für Motilität, sowie Elastase, Pyocyanin und 3-oxo-C12-HSL Produktion. In einem abgestimmten Ansatz aus RNA-Seq von einem PA2226 Überproduzierer, QS Reporter Gen Assays in E. coli und weiteren phänotypischen Tests, konnte PA2226 als verantwortliche Ursache identifiziert und zentrale QS Mechanismen als potenzielles Ziel ausgemacht werden. Die erhaltenen RNA-Seq Daten waren in großer Übereinstimmung mit dem kürzlich beschriebenen zentralem QS Regulon von P. aeruginosa PAO1. Unter den differenziell exprimierten Genen konnten die Elastase lasB, der QS Regulator rsaL, die AI Synthase rhlI, die Gene für Hydrogencyanidbildung hcnABC und ambBCDE, welche in der Syn-these von IQS involviert sind, beobachtet werden. Darüber hinaus wurde deutlich, dass die Überexpression von PA2226 großen Einfluss auf die Genexpression von Genen hat, welche zu den funktionellen Klassen der „Sekretierten Faktoren“ und der „Protein Sekretion/Export“ gehören. Weitere Überexpression von PA2226 in E. coli zeigte, dass der hier beinhaltende QS Reporter nicht aktiviert wird, was QS aktive Promotoren und LasR als essentielle Bestandteile des Mechanismus identifiziert. Nachdem eine Interak-tion von rekombinantem PA2226 mit QS aktiven Promotoren mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) ausgeschlossen werden konnte, erschien LasR als wahr-scheinlichstes Ziel. Im Nachfolgenden konnte durch Kopräzipitation von rekombinantem PA2226 und LasR aus Zellrohextrakten gezeigt werden, dass die regulatorische Funkti-on von PA2226 eng mit diesem QS Regulator verbunden ist. Dies korreliert mit der Be-obachtung, dass QS Phänotypen partiell wiederhergestellt werden konnten wenn LasR und PA2226 gleichzeitig exprimiert wurden, öffnet aber die Möglichkeit mindestens ei-nes weiteren Interaktionspartners. Indem sich Next Generation Sequencing bei der Analyse eines PAO1 Stammes mit starken Quorum Quenching Phänotypen zu Nutze gemacht wurde, konnte ein neuer QS Regulator identifiziert und charakterisiert werden, womit das Wissen um das komplexe QS Netzwerk von P. aeruginosa erweitert wurde.de
dc.language.isoenen
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.subjectRNA-seqde
dc.subjectLasRde
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften, Biologie
dc.titleRNA-seq based identification and biochemical characterization of the Pseudomonas Aeruginosa LasR and Quorum Sensing anti-activator PA2226en
dc.title.alternativeRNA-seq basierte Identifikation und biochemische Charakterisierung des Pseudomonas aeruginosa LasR und Quorum Sensing Antiaktivators PA2226de
dc.typedoctoralThesis
dcterms.dateAccepted2016-10-28
dc.rights.ccNo license
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subject.bcl42.13 Molekularbiologie
dc.subject.bcl42.30 Mikrobiologie
dc.subject.gndPseudomonas aeruginosa
dc.subject.gndQuorum sensing
dc.subject.gndTranskriptom
dc.subject.gndRegulation
dc.subject.gndRepressorproteine
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.thesisdoctoralThesis
tuhh.opus.id10306
tuhh.opus.datecreation2020-04-15
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentBiologie
thesis.grantor.placeHamburg
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburg
dcterms.DCMITypeText-
tuhh.gvk.ppn1697576443
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-103066
item.fulltextWith Fulltext-
item.creatorOrcidUtpatel, Christian-
item.grantfulltextopen-
item.advisorGNDStreit, Wolfgang (Prof. Dr.)-
item.languageiso639-1other-
item.creatorGNDUtpatel, Christian-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
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