Quorum sensing-dependent expression of small proteins andstructural analysis of new class of quorum quenching enzymes

Abstract

Many bacterial processes such as pathogenicity or symbiosis are controlled by an autoinducer (AI) based communication known as quorum sensing (QS). The plant symbiont Sinorhizobium fredii NGR234 shows a unique and diverse tool to fix nitrogen in more than 120 plant genera. All genes that are important for establishing the symbiosis are located on the symbiotic plasmid pNGR234a. A deletion of both AI synthases in Sinorhizobium fredii NGR24 results in an upregulation of nearly all genes on pNGR234a, which can be used as a fantastic tool to analyze the expression of small proteins on pNGR234a in a QS dependent manner. A combination of an ORF search and mapping these resulting new ORFs to the transcriptomic profile resulted in an identification of 251 additional small ORFs with a size between 33 nts (10 aa) and 183 nts (60 aa). Additionally, an operon containing three smORFs located in-between traI and repA was identified and showed impact to symbiotic plasmid maintenance. The corresponding protein were designated RepX (51 aa), RepY (57 aa) and RepA0 (143 aa). However, a fourth small protein locating on pNGR234a is coded by the smORF NGR_a01725 (78 nts, 25 aa). Mutagenesis approaches, immunoblotting with specific polyclonal antibodies and studies with translation fusion verified the expression of these smORFs to functional proteins and the essential to plasmid replication and stability. Bacterial communication via QS can be interrupted by inactivating AI molecules that was catalyzed by quorum quenching (QQ) enzymes. The QQ protein, designated GqqA, from Komagataeibacter europaeus CECT 8546 shows highly similarity to prephenate dehydratase (PDT) and strongly interferes with N-acyl-homoserine lactone (AHL) QS signals. A previous study demonstrated that GqqA cannot complement an E. coli PDT enzyme but affects QS dependent biofilm formation in K. europaeus CECT 8546. Here, ESI-MS/MS measurements using a GqqA in vitro enzyme assay with 3-oxo-C8-HSL as substrate imply that GqqA cleaves the amide bond and releases a lactone ring and the corresponding acyl acid. Due to the structure similarity to PDT enzymes and the acylase activity GqqA represents the first member of a novel type of acylases involved in bacterial QQ.

Wie Pathogenität oder Symbiose werden viele bakterielle Prozesse durch eine chemisch basierte Kommunikation gesteuert, die als Quorum Sensing (QS) bekannt ist. So ist der Pflanzensymbiont Sinorhizobium fredii NGR234 in der Lage in einer QS gesteuerten Symbiose in mehr als 120 Pflanzenarten Stickstoff zu fixieren. Alle Gene, die in der Stickstofffixierung involviert sind, liegen auf dem symbiotischen Plasmid pNGR234a. Da durch eine Deletion beider AI Synthasen, sämtliche Gene auf pNGR234a hochreguliert werden, kann NGR234 als ein fantastischer Untersuchungsorganismus verwendet werden, um die Expression von kleinen Proteinen auf pNGR234a in einer QS-abhängigen Weise zu analysieren. Durch eine Kombination einer ORF-Suche mit der Zuordnung der resultierenden kleinen ORFs zum Transkriptom von NGR234, konnten 251 zusätzliche kleine ORFs mit einer Größe zwischen 33 nts (10 aa) und 183 nts (60 aa) identifiziert werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass zwischen den Genen traI du repA ein Operon liegt, welches aus drei kleine ORFs besteht und Auswirkungen auf die Plasmiderhaltung hat. Die entsprechenden Proteine wurden als RepX (51 aa), RepY (57 aa) und RepA0 (143 aa) bezeichnet. Ein weiteres kleines Protein, welches identifiziert wurde, wird durch den kleinen ORF NGR_a01725 kodiert und weist eine Größe von 25 aa auf. Mittels Mutagenese, Immundetektion mit spezifischen Antikörpern und Translationfusionen konnten die Expressionen dieser kleinen ORFs zu funktionellen Proteinen und deren Einfluss auf die Plasmidreplikation und -stabilität nachgewiesen werden. Die bakterielle Kommunikation mittels QS kann durch Inaktivierung von den AI Molekülen gestört werden, was mittels Quorum Quenching (QQ) Enzymen katalysiert wird. Das QQ Protein, genannt GqqA, aus Komagataeibacter europaeus CECT8546 zeigt eine große Ähnlichkeit zu Prephenat-Dehydratasen (PDT) und zeigt Störungen der N-Akylhomoserin Laktone QS Signale. Frühere Studien zeigten, dass GqqA ein E. coli PDT-Enzym nicht komplementieren kann, sondern die QS abhängige Biofilmbildung in K. europaeus CECT 8546 beeinflusst. ESI-MS/MS-Messungen mit einem GqqA in vitro Enzymassay mit 3-oxo-C8-HSL als Substrat zeigt, dass GqqA in der Lage ist die Amid Bindung zu spaltet und einen Laktonring und die zugehörige Akylsäure freisetzt. Aufgrund der Strukturähnlichkeit zu PDT-Enzymen und der Acylasen Aktivität stellt GqqA das erste Mitglied einer neuartigen Klasse von Acylasen da, die bakterielle QQ Eigenschaft besitzt.