Vergleichende Analyse von Nanobodies und monoklonalen Antikörpern gegen humanes CD38 für die NIRF-Bildgebung von Lymphomen in vivo

Abstract

In den letzten Jahrzehnten wurden vielfältige medizinische Anwendungsmöglichkeiten für Antikörper etabliert, u.a. für die Diagnostik von Tumorerkrankungen. Die lange Verweildauer monoklonaler Antikörper (mAk) im Blutkreislauf ist bei deren Anwendung zur spezifischen Tumorbildgebung ein Nachteil, da sie zu hohen Hintergrundwerten und einem niedrigen Tumor-zu-Hintergrundverhältnis (T/H-Verhältnis) führt. Nanobodies stellen die antigenbindende Domäne von Schwere-Ketten-Antikörpern dar und sind zehnmal kleiner als mAk. Sie werden renal filtriert, weshalb überschüssige, nicht an Zielzellen gebundene Moleküle schneller eliminiert werden. Für die bildgebende Diagnostik stellen Nanobodies deshalb eine interessante Alternative zu mAk dar. In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften des mAk A10 mit denen des Nanobodies MU1067 bei der in vivo Bildgebung von Lymphomen verglichen. Beide Antikörperformate binden spezifisch an das humane Oberflächenantigen CD38, welches von bestimmten Lymphomzellreihen überexprimiert wird. Der Nanobody und der mAk wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff AF680 markiert, um im Anschluss Nahinfrarot-Fluoreszenz- (NIRF-) Aufnahmen anzufertigen. Das Gen für humanes CD38 wurde in murine Lymphomzellen eingebracht, sodass diese humanes CD38 auf der Oberfläche exprimierten. Vor den in vivo Experimenten wurde die spezifische Bindung beider Antikörperformate in vitro per Durchflusszytometrie (FACS) und im In Vivo Imaging System (IVIS) nachgewiesen. In vivo NIRF-Aufnahmen im IVIS an tumortragenden Mäusen zeigten, dass MU1067-Nanobodies schneller im Tumorgewebe akkumulieren als die größeren konventionellen A10-Antikörper. Während mit dem MU1067-Nanobody signifikante Signalintensitätsunterschiede zwischen Ziel- und Kontrolltumor bereits 4 Stunden nach Injektion gefunden wurden, wurde erst 24 Stunden nach Injektion von A10 ein signifikanter Kontrast erreicht. Dabei führte eine höhere Dosis MU1067 von 50 µg gegenüber 10 µg zu einer Steigerung der Absolutwerte im Zieltumor, während die Hintergrundwerte in geringerem Maße stiegen, was in höheren T/H-Verhältnissen resultierte. Dieser Effekt fiel in der A10-Gruppe deutlich geringer aus. Die schnelle Eliminierung von MU1067 einerseits und die längere Verweildauer von A10 im Blutkreislauf andererseits konnte durch Serum- und Urinanalysen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion gezeigt werden. Ex vivo Analysen bestätigten die Resultate aus den in vivo Aufnahmen. Die Ergebnisse legen nahe, dass mit beiden Antikörperformaten eine in vivo Bildgebung möglich ist, jedoch nur die Applikation von MU1067 aussagekräftige Aufnahmen am Tag der Injektion zulässt. Sie könnten dazu beitragen, die spezifische diagnostische Bildgebung onkologischer Erkrankungen in der Zukunft zu verbessern.

Over the last decades numerous medical applications using antibodies have been established, amongst others diagnostic tools for the detection of tumors. Monoclonal antibodies (mAb) typically have a long retention time in the bloodstream leading to high background levels and resulting in low tumor-to-background ratios (TBR) when used for tumor imaging. In contrast, nanobodies consist of only the antigen binding domain of a heavy-chain-only antibody and are ten times smaller than mAb. Therefore, excessive non-bound molecules can be renally excreted rapidly. For this reason, nanobodies can be a promising alternative to mAb for diagnostic imaging. The aim of this study was to compare the characteristics of mAb A10 and nanobody MU1067 for in vivo imaging of lymphomas, both of which specifically bind to human CD38. CD38 is a surface antigen that is overexpressed by particular lymphoma strains. The nanobody and the mAb were loaded with the fluorescence dye AF680 to perform near-infrared fluorescence (NIRF) imaging. The genetic code for human CD38 was transferred to murine lymphoma cells causing expression of human CD38 on their cell surface. Prior to in vivo experiments, the specific binding of both antibodies was shown in vitro using flow cytometry (FACS) analysis and an in vivo imaging system (IVIS). In vivo NIRF images of tumor-bearing mice showed a faster accumulation of MU1067 nanobodies in the tumor than the bigger conventional mAb A10. Regarding the signal intensity between target tumor and control tumor, the nanobody MU1067 showed significant divergence already 4 hours after the injection. In contrast, when using mAb A10, it took 24 hours until a significant level of contrast was reached. The same experiments revealed that the use of a higher MU1067 dose of 50 µg compared to 10 µg leads to higher absolute signal values in the target tumor while the background levels rise to a lesser extent, resulting in higher TBRs. This effect was less significant when A10 was used. The faster clearance of MU1067 as well as the longer retention time in the blood stream of A10 were verified by analysis of blood and urine samples of the tumor-bearing mice taken at various points of time after the injection. The in vivo findings were confirmed by ex vivo analyses. These results suggest a suitability of both antibodies for in vivo imaging in general. However, of the two entities, only the nanobody MU1067 allows reliable same-day in vivo imaging. Thus, these nanobodies could contribute to the improvement of future specific diagnostic imaging techniques in oncology.