Analyse von S. pneumoniae-abhängigen Phänomenen an Purinrezeptor P2Y2 in Alveolarepithelzellen

Abstract

In dieser Arbeit konnte eine bisher unentdeckte Interaktion zwischen S. pneumoniae (Pneumokokken) und P2Y2-Rezeptoren gezeigt werden, welche zur Inaktivierung und Internalisierung des Rezeptors führt. P2Y2-Rezeptoren sind unter anderem für die Surfactant-Sekretion, das Aktinskelett und den Wasserhaushalt in der Alveole zuständig. Es wurde eine Variante des P2Y2-Rezeptors kloniert, bei der die Phosphorylierungsstellen der Proteinkinase C (PK-C), durch Punktmutationen deletiert wurden. Alveolarepithelzellen wurden entweder mit dem Wildtyp oder der mutierten Variante des Rezeptors transfiziert und mit Pneumokokken vorinkubiert. Eine Stimulation des Rezeptors mit dem natürlichen Agonisten ATP ergab ein normales zytosolisches Calciumsignal bei der mutierten Variante, während dies bei Verwendung des Wildtyp-Rezeptors ausblieb. Die Phosphorylierungsstellen der PK-C scheinen somit bei der Pneumokokken-induzierten Inaktivierung eine wichtige Rolle zu spielen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Pneumokokken die Internalisierung sowohl beim Wildtyp-Rezeptor, als auch bei der mutierten Variante des P2Y2-Rezeptors bewirken, während Stimulation der Zellen mit ATP nur beim Wildtyp zur Internalisierung führt. Die Phosphorylierungsstellen der PK-C, welche bei der Pneumokokken-induzierten Inaktivierung des Rezeptors wichtig sind, scheinen bei der Internalisierung eine untergeordnete Rolle zu spielen. In einem Phos-tag Western-Blot konnte abermals eine durch Pneumokokken herbeigeführte Phosphorylierung am P2Y2-Rezeptor nachgewiesen werden. In Versuchen an Alveolarepithelzellen zum Aktinauf- und -abbau konnte ein Phänomen gezeigt werden, bei dem Stimulation mit ATP zu einem Aufbau, während Inkubation mit Pneumokokken zu einem signifikanten Abbau von Aktinstrukturen führte.

The experiments for this doctoral thesis uncovered an interaction between S. pneumoniae and P2Y2-receptors which leads to inactivation and internalization of said receptor. P2Y2-receptors are, among others, responsible for secretion of surfactant and fluid management in the lung. This interaction might be partly responsible for potentially life threatening pulmonary edema or atelectasis which can occur during a S. pneumoniae-induced pneumonia. A variant of the P2Y2-receptor with three deleted PKC-phosphorylation sites was cloned. Cells were transfected with either the wildtype or mutant receptor and preincubated with S. pneumoniae. Stimulation of these cells with ATP, the natural agonist, showed an intact calcium signal in cells expressing the mutant P2Y2-receptor, while cells expressing the wild type receptor showed no reaction, which indicates the deleted phosphorylation sites prevent the mutant receptor from being inactivated by S. pneumoniae. It could be shown that incubation with S. pneumoniae leads to internalization of the P2Y2- receptor in the wildtype as well as in the mutant variant, while stimulation with ATP did not result in internalization of the mutant receptor but led to a strong internalization of the wildtype receptor. This could imply that the phosphorylation sites of the PKC only play a marginal role concerning P2Y2, but not agonist induced internalization. For direct verification of a S. pneumoniae-induced phosphorylation of the P2Y2-receptor a Phos-tag Western-Blot was performed. It has been shown that phosphorylation of the recep- tor is increasing over time, when cells are incubated with S. pneumoniae. The functional importance of this phenomenon has been shown in experiments concerning actin filaments. Cells stimulated with ATP showed increased production of actin, while incubation with S. pneumoniae led to a significant loss of actin filaments. Conclusion: S. pneumoniae leads to inactivation and internalization of P2Y2-receptors via phosphorylation. Incubation with S. pneumoniae leads to significant loss of actin filaments in vitro.