Evaluation of drug therapies targeting calcium homeostasis in a mouse model of hypertrophic cardiomyopathy

Abstract

Cardiovascular diseases are the number one cause of death worldwide. A part of these diseases is caused by genetic defects, and the most common genetic cardiovascular disorder is hypertrophic cardiomyopathy (HCM). The vast majority of the mutations underlying HCM are in genes encoding for sarcomeric proteins, and one of the two most frequently affected genes is MYBPC3, which encodes cardiac myosin binding protein C (cMyBP-C). This protein is associated to the thick filament and interacts with myosin and titin, but also with the thin filament protein actin. Thereby, it regulates myosin-actin interaction and, consequently, contraction. Mutations in MYBPC3 and other myofilament-associated genes oftentimes lead to protein insufficiencies and are commonly accompanied by a sensitization of the myofilament to Ca2+, which is considered one of the underlying defects of HCM and, therefore, a possible target for HCM therapy.

In this study, the used murine Mybpc3-targeted knock-in (KI) mouse model recapitulates these phenotypic aspects of HCM. The aim of this work was to evaluate if increased myofilament Ca2+ sensitivity is the underlying cause of the contractile and Ca2+ transient phenotype of cardiac myocytes isolated from Mybpc3-KI mice and to test pharmacological therapy approaches intervening at the level of Ca2+ homeostasis and myofilament Ca2+ sensitivity.

Isolated cardiac myocytes of Mybpc3-KI mice displayed shorter diastolic sarcomere lengths than wild-type cells, showed a higher inotropic response to β-adrenergic stimulation with increased contraction and relaxation times, and suffered from a drastic reduction of diastolic sarcomere length when challenged with high workload of β-adrenergic stimulation and high pacing frequency. A similar phenotype could be elicited in WT cardiac myocytes with the Ca2+ sensitizer EMD 57033, and the Ca2+-desensitizing myosin ATPase inhibitor blebbistatin could partially improve the KI phenotype. This supports the theory of myofilament Ca2+ hypersensitivity being an underlying problem in HCM.

The Ca2+ channel blocker diltiazem and the late sodium current inhibitor ranolazine, which has also been reported to have Ca2+ desensitizing properties, were both able to improve diastolic sarcomere length of Mybpc3-KI cells challenged with high workload. Diltiazem also induced the adverse side effect of a negative force-frequency relationship, while concentration-response experiments with isoprenaline and protein phosphorylation analysis revealed β-adrenergic antagonism of ranolazine at concentrations which are considered to be its therapeutic range of action. This should be considered in pharmacological therapy of HCM patients.

Six month treatment of hypertrophic Mybpc3-KI mice with diltiazem or the β-blocker metoprolol failed to significantly improve cardiac function or hypertrophy. Ranolazine induced slight tendencies to improved systolic and diastolic function parameters, indicating its possible usefulness in HCM therapy. Its effects should be further evaluated by measurement of mRNA and protein hypertrophy markers, and subsequently, ranolazine can be tested in a larger animal model.

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Viele dieser Erkrankungen haben einen genetischen Hintergrund, und die häufigste durch Mutationen verursachte Herzerkrankung ist die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM). Fast alle mit der HCM assoziierten Mutationen treten in Genen auf, die für Proteine des Sarkomers kodieren. Eins von den zwei am häufigsten betroffenen Genen ist dabei MYBPC3, welches für das Sarkomerprotein cMyBP-C kodiert. Dieses Protein interagiert sowohl mit Komponenten des dicken Filaments (Myosin und Titin) als auch mit Aktin, dem Hauptbestandteil des dünnen Filaments. Hierdurch nimmt cMyBP-C eine regulierende Funktion bezüglich der Interaktion von Myosin und Aktin, und damit im Endeffekt der Kontraktion, ein. Mutationen in MYBPC3 sowie anderen HCM-assoziierten Genen führen häufig zu einer Haploinsuffizienz und verursachen oft eine Sensitisierung des Myofilaments gegenüber Ca2+. Diese wird als mögliche Ursache der HCM angesehen und ist deshalb potentieller Ansatzpunkt für die Therapie der Krankheit.

In dieser Arbeit wurde ein knock-in (KI) Mausmodell untersucht, welches eine Mutation im Mybpc3 Gen trägt und die angesprochenen phänotypischen Aspekte der HCM aufweist. Erstes Ziel der Arbeit war zu evaluieren, ob die hohe Ca2+-Sensitivität der Myofilamente Ursache für phänotypische Aspekte bezüglich der kontraktilen Eigenschaften und des intrazellulären Ca2+ Transienten in isolierten Mybpc3-KI Herzmuskelzellen ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde getestet, wie sich pharmakologische Therapien auswirken, die den intrazellulären Ca2+-Haushalt und die Ca2+-Sensitivität der Myofilamente verändern.

Isolierte Herzmuskelzellen von Mybpc3-KI Mäusen zeigten eine kürzere diastolische Sarkomerlänge als Zellen von Wildtyp-Mäusen (WT). Beta-adrenerge Stimulation rief in ihnen einen stärkeren Anstieg der kontraktilen Verkürzung mit verlängerten Kontraktions- und Relaxationszeiten hervor. Eine erhöhte Arbeitslast durch β-adrenerge Stimulation in Kombination mit hoher Stimulationsfrequenz führte zu einer drastischen Verkürzung der diastolischen Sarkomerlänge. Ein ähnlicher Phänotyp konnte in WT-Herzmuskelzellen durch die Anwendung des Ca2+-Sensitisierers EMD 57033 hervorgerufen werden, und der Ca2+-desensitisierende Myosin-ATPase-Inhibitor Blebbistatin konnte den Phänotyp von KI-Zellen partiell verbessern. Dies spricht dafür, dass die erhöhte Ca2+-Sensitivität der Myofilamente in der Tat ein grundlegendes Problem der HCM ist.

Sowohl der Ca2+-Kanalblocker Diltiazem als auch Ranolazin, ein Blocker des späten Natriumstroms, der auch Ca2+-desensitierende Eigenschaften besitzen soll, konnten die diastolische Funktion von Mybpc3-KI Herzmuskelzellen unter erhöhter Arbeitslast verbessern. Dabei verursachte Diltiazem als Nebenwirkung eine negative Kraft-Frequenz-Beziehung. Konzentrations-Wirkungs-Experimente mit Isoprenalin und die Messung von Phosporylierungszuständen kardialer Proteine zeigten, dass Ranolazin in den eingesetzten Konzentrationen einen β-adrenergen Antagonismus ausübt. Da dies Konzentrationen sind, die als therapeutisch angesehen werden, sollte dies bei der pharmakologischen Therapie der HCM berücksichtigt werden.

Die sechsmonatige Behandlung von hypertrophen Mybpc3-KI Mäusen mit Diltiazem oder dem β-Blocker Metoprolol konnte weder die Herzfunktion verbessern noch die Hypertrophie verringern. Der Einsatz von Ranolazin führte tendenziell zu leichten Verbesserungen in Parametern der systolischen und diastolischen Herzfunktion, was einen möglichen Nutzen von Ranolazin in der HCM-Therapie unterstreicht. Zur weiteren Charakterisierung der Wirkung von Ranolazin sollten Hypertrophiemarker auf mRNA- und Protein-Ebene gemessen werden. Im nächsten Schritt kann Ranolazin dann im Großtiermodell getestet werden.