| Zusammenfassung: | Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) sind Serin-/Threonin-spezifische Proteinkinasen, die in eukaryotischen Zellen an zahlreichen Prozessen wie Embryogenese, Zelldifferenzierung, Zellproliferation, dem Überleben der Zelle, aber auch dem Zelltod beteiligt sind. Im Malaria-Erreger Plasmodium sind zwei Vertreter der MAPK (MAPK1, MAPK2) identifiziert worden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezei... Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) sind Serin-/Threonin-spezifische Proteinkinasen, die in eukaryotischen Zellen an zahlreichen Prozessen wie Embryogenese, Zelldifferenzierung, Zellproliferation, dem Überleben der Zelle, aber auch dem Zelltod beteiligt sind. Im Malaria-Erreger Plasmodium sind zwei Vertreter der MAPK (MAPK1, MAPK2) identifiziert worden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entsprechenden Gene (pbmapk1, pbmapk2) während der gesamten Entwicklung von Plasmodium berghei in der Leber transkribiert werden. Durch eine Fusion des endogenen pbmapk1-Lokus mit gfp konnte die Expression des Proteins sowohl in der Blut- als auch in der Leberphase nachgewiesen werden. Die im live imaging beobachtete Lokalisation der endogenen PbMAPK1 als GFP-Fusionsprotein bestätigt hierbei das in vorangegangenen Arbeiten beschriebene dynamische Lokalisationsmuster der überexprimierten PbMAPK1 als GFP-Fusionsprotein. Zu Beginn der Karyokinese lokalisiert die PbMAPK1 in den Kernen des frühen Leberschizonten und bildet später im Zytomerstadium, zu Beginn der Zytokinese, distinkte Strukturen in der Nähe der Parasitenkerne und der invaginierenden Parasitenmembran aus. In Bezug auf die Kernlokalisation der PbMAPK1 konnten funktionale Kernlokalisationssignale (NLS, nuclear localization signal) in der C-terminalen Domäne identifiziert werden. Die distinkten Strukturen der PbMAPK1 während des Zytomer-Stadiums in der Leberphase könnten für eine Beteiligung am Zytokinese-Prozess sprechen. Die mit der PbMAPK1 vergleichbaren Lokalisationsmuster der im Rahmen dieser Arbeit visualisierten Komponenten des Zytokinese-Apparates des Parasiten (Centrosomen und das Phosphatidylinositol PI3P) unterstützen diese These. Interessanterweise zeigten pbmapk1-defiziente Parasiten gegenüber dem Wildtyp keine Veränderungen während der Entwicklung in der Leber hinsichtlich Infektiösität, Viabilität und Morphologie. Um einen Unterschied in Bezug auf die mRNA-Expression des Gens pbmapk2 identifizieren zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals die Methode der quantitativen real-time PCR für die Analyse von relativen Expressionslevel in Plasmodium- Leberstadien etabliert. Die Ergebnisse zeigten eine verstärkte Transkription der pbmapk2 in pbmapk1-defizienten-Parasiten während des Karyokinese-Prozesses. Dies könnte ein Hinweis auf eine funktionelle Kompensation der fehlenden PbMAPK1 durch die PbMAPK2 sein. Allerdings konnten keine Veränderungen in Bezug auf die Lokalisation der überexprimierten PbMAPK2 als GFP-Fusionsprotein in pbmapk1-defizienten Parasiten während des Leberstadiums beobachtet werden. Die PbMAPK2 zeigte als überexprimiertes GFP-Fusionsprotein im live imaging eine dauerhafte Assoziation mit den Kernen des Parasiten während der gesamten Leberphase.
Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are serine/threonine- specific protein kinases and are involved in numerous processes including embryogenesis, differentiation, proliferation, cell survival and apoptosis in eukaryotic cells. In Plasmodium, the causative agent of malaria, two MAPKs were identified (MAPK1 and MAPK2). This work shows that both corresponding genes are transcribed throughout l... Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are serine/threonine- specific protein kinases and are involved in numerous processes including embryogenesis, differentiation, proliferation, cell survival and apoptosis in eukaryotic cells. In Plasmodium, the causative agent of malaria, two MAPKs were identified (MAPK1 and MAPK2). This work shows that both corresponding genes are transcribed throughout liver stage development of Plasmodium berghei. GFP-tagging of the endogenous PbMAPK1 revealed protein expression in blood and liver stages. The observed subcellular localization of the endogenous protein by live imaging verified the localization pattern observed when PbMAPK1 was overexpressed as a GFP fusion protein in previous studies. At the beginning of karyokinesis, PbMAPK1 localizes to the parasite nuclei of early liver stage schizonts. This work shows that the nuclear localization is mediated by functional nuclear localization signals (NLSs) in the C-terminal domain. In contrast, during the cytomere stage, the starting point of cytokinesis, the PbMAPK1 forms distinct structures in proximity to the parasite nuclei and the invaginating parasite plasma membrane. The visualization of components of the cytokinesis machinery (centrosomes and phosphatidylinositol PI3P) showed a localization pattern resembling that of PbMAPK1, supporting the hypothesis that PbMAPK1 is involved in parasite cytokinesis. However, pbmapk1-knockout parasites showed no differences to wild-type parasites in terms of infectivity, viability and morphology during liver stage development. To reveal whether this lack of phenotype might be due to upregulation of pbmapk2 mRNA levels, quantitative real time PCR was established for Plasmodium berghei liver stages for the first time. Indeed, the results showed an upregulation in pbmapk2 mRNA expression in pbmapk1-knockout parasites, hinting at functional compensation by PbMAPK2. Despite this, no change in the localization of GFP-tagged PbMAPK2 could be detected in pbmapk1-knockout parasites; the PbMAPK2 showed a permanent association to the parasite nuclei throughout the liver stage. |
