Mentale Retardierung bei Phenylketonuie : Einfluss erhöhter Phenylalaninspiegel auf die synaptische Konnektivität im Hippokampus

Abstract

Die humane Stoffwechselerkrankung Phenylketonurie (PKU) zeichnet sich durch stark erhöhte Konzentrationen der Aminosäure in Plasma und Liquor aus. Verursacht wird die Zunahme der Aminosäurekonzentration durch einen genetisch bedingten Funktionsverlust des Enzyms Phenylalaninhydroxylase, welches die Aminosäure in den Metaboliten Tyrosin hydroxyliert. In Folge der Mutation sind betroffene Kinder postnatal regelhaft mental retardiert. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen dieser mentalen Retardierung sind nicht geklärt. Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe an der Pahenu2 Maus, einem etablierten PKU Mausmodell, zeigten ein deutlich verzögertes synpatisches Pruning im Hippocampus, was zu einer signifikant erhöhten Anzahl an Synapsen in adulten Tieren führte. Postnatales synaptisches Pruning dient der Elimination schwacher Synapsen durch Mikroglia, deren Aktivierung C3-Komplement abhängig ist. Die erhöhte Anzahl an Synapsen war von einer reduzierten Expression präsynaptischer Proteine und einer erhöhten Expression postsynaptischer Proteine begleitet. In elektrophysiologischen Untersuchungen wurde zudem deutlich reduzierte neuronale Aktivität nachgewiesen (Horling and Schlegel et al., 2014). Im Ergebnis ist davon auszugehen, dass die synaptische Konnektivität im Hippocampus durch verzögertes synaptisches Pruning nachhaltig gestört ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht welche dieser Effekte auf die synaptische Konnektivität auf die hohen Konzentrationen von Phenylalanin bei der Phenylketonurie zurückzuführen sind. Aus diesem Grund wurden Analysen an den etablierten Modellen der hippocampalen Dispersionskultur sowie der organotypischen hippocamplen Gewebekultur durchgeführt. Der Hippocampus ist für das Lernen und die Gedächtniskonsolidierung elementar und deshalb für Untersuchungen zu mentaler Retardierung besonders geeignet. In den hippocampalen Dispersionskulturen führten stark erhöhte Konzentrationen von Phenylalanin zu einer reduzierten Dendritenverzweigung, gering gradig erhöhte hingegen zu einer gesteigerten. Dosisunabhängig kam es dagegen zu einer Erhöhung der Spinedichte. Die Expression der untersuchten präsynaptischen Proteine war durch Phenylalanin herunterreguliert, hingegen die der postsynaptischen Proteine heraufreguliert. In den organotypischen Gewebekulturen bewirkte Phenylalanin eine Reduktion der Anzahl an Spinesynapsen in der CA1 Region, in der CA3 Region dagegen dosisabhängig eine gesteigerterten Anzahl. Untersuchungen des Einflusses von Phenylalnin auf das Aktinzytoskelett zeigten einen deutlichen Einfluss höherer Konzentrationen auf dessen Ausbildung und Reorganisation. Phenylalanin beeinflusste dosisabhängig die Expression der Proteine CaMKII und Rac1, die im Rahmen eines zusammenhängenden Signalwegs, der die gefundenen morphologischen Veränderungen verursachen könnte, untersucht wurde. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob Phenylalanin die Mikroglia beeinflusst. In der Pahenu2 Maus konnte eine reduzierte Mikrogliaaktivität im Hippocampus adulter Tiere gezeigt werden. mRNA Messungen zeigten zudem eine mögliche Beteiligung des Komplementfaktors C3 und des Rezeptors CX3CR1 im Mausmodell auf. Untersuchungen in hippocampalen Gewebekulturen hingegen machten deutlich, dass Phenylalanin keinen direkten Einfluss auf die Aktivität der Mikroglia besitzt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie deutlich die Notwendigkeit der lebenslangen, Phenylalanin-reduzierten Diät Betroffener auf, da Phenylalanin nicht nur über die verminderte Aktivierung von Mikrogliazellen Einfluss auf die frühe postnatale Entwicklung nimmt, sondern auch direkt die Morphologie und Funktionaltät hippocampaler Neurone nachteilig beeinflusst. Die Untersuchungen bilden die Grundlage für weiterführende Analysen mit der Möglichkeit, eine zukünfige alternative Therapieoption zu entwickeln.

The human metabolic disorder phenylketonuria (PKU) is characterized by elevation of the amino acid phenylalanine in plasma and liquor. This is due to genetic loss of function of the enzyme phenylalanine hydroxylase, phenylalanine is not hydroxylated into its metabolite tyrosine. Subsequently, the children affected develop a severe mental retardation postnatally. The underlying pathomechanisms of the mental retardation are still unknown. Studies of our group have revealed delayed synaptic pruning in the hippocampus of the Pahenu2 mouse, a well established PKU model. This delay results in a significantly increased number of synapses in adult animals. Postnatal synaptic pruning leads to the elimination of weak synapses by microglia, which are activated in a C3-complement-dependent manner. The increased number of synapses is accompanied by a reduced expression of presynaptic proteins and an increased expression of postsynaptic proteins. Furthermore, electrophysiological examinations have revealed an obvious reduction in neuronal activity (Horling and Schlegel et al., 2014). In summary, we can assume that synaptic connectivity is sustainably disturbed due to delayed synaptic pruning. In this study the question was analysed as to which of the effects on synaptic connectivity is caused by the elevated levels of phenylalanine occurring by phenylketonuria. Therefore, analyses were performed in the well-established models of hippocampal dispersion culture and hippocampal slice culture. The hippocampus is crucial for learning and memory and is therefore an appropriate subject for research concerning mental retardation. In hippocampal dispersion cultures high concentrations of phenylalanine resulted in reduced dendritic arborization. Sslightly elevated concentrations, however, resulted in increased dendritic arborization. Phnylalanine resulted dose-independently in an increase in spine desity. The expression of the presynaptic proteins was downregulated by elevated levels of phenylalanine, whereas the expression of postsynaptic proteins was upregulated. In hippocampal slice cultures, phenylalanine reduced the number of spine synapses in the CA1 region, but resultet dose-dependently in an increased amount in the CA3 region. Examination of the influence of phenylalanine on the actin cytoskeletal showed a direct effect of elevated levels on the formation and rearrangement. Phenylalanine also affected the expression of the proteins CaMKII and Rac1 dose-dependently. The proteins are part of a signaling pathway leading to the morphological alterations found in hippocampal dispersion cultures. The second part of the study focuses on the influence of phenylalanin on microglia activity. In the hippocampus of adult Pahenu2 mice reduced microglia activity was found. This was accompanied by reduced mRNA levels of the complement component C3 and the receptor CX3CR1. Examinations in hippocampal slice cultures clearly demonstrate that phenylalanine does not directly influence the activity of microglia. In conclusion the findings of this study clearly demonstrate the necessity of a lifelong phenylalanine-restricted diet for PKU patients, as the amino acid influences not only early postnatal development by reduced activation of microglia but also directly affects the morphology and functionality of hippocampal neurons. The findings are a basis for continuing analyses, regarding the development of alternative therapeutical options.