Bedeutung der EGFRvIII-Expression für die Radio- und Chemosensitivität von humanen Glioblastomzellen

Abstract

Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) wird in 40-50% aller Glioblastome (GBM) aufgrund einer Genamplifikation überexprimiert. Ungefähr die Hälfte dieser Tumoren exprimiert außerdem die Deletionsmutante EGFRvIII. Erste Studien, die transfizierte Zellen nutzten zeigten, dass eine erhöhte EGFRvIII-Expression zu einer Resistenz gegenüber ionisierenden Strahlen führt und dementsprechend eine Inhibition des EGFR eine Radiosensitivierung bewirkt. Hinsichtlich der Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika ist bisher jedoch kein eindeutiger entsprechender Zusammenhang beschrieben worden. Ausgehend von den klinischen Studien ist es bislang aber unklar, ob eine EGFRvIII-Expression eine prognostische Relevanz für das Überleben von GBM-Patienten nach Radiochemotherapie hat. Vor diesem Hintergrund sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, welchen Einfluss der EGFRvIII zum einen auf die Strahlenempfindlichkeit von GBM-Zellen mit und ohne EGFR-Inhibition und zum anderen auf eine Chemotherapie mittels Temozolomid (TMZ) hat. Die Studien sollten jedoch in nicht transfizierten GBM-Zellen mit endogener EGFRvIII-Expression durchgeführt werden. Extra für diese Untersuchungen wurden daher aus zwei unabhängigen O6-Methylguanin-Methyl-transferase- (MGMT) negativen und EGFRvIII-positiven GBM-Zelllinien (DKMG, BS153) isogenetische SubZellinien mit geringer (EGFRvIII−) oder hoher (EGFRvIII+) EGFRvIII-Expression generiert. Die Charakterisierung dieser Sub-Zelllinien zeigte für EGFRvIII+-Zellen im Vergleich zu EGFRvIII−-Zellen lediglich eine moderate Aktivierung des MAPK- und des AKT/PI3K-Signalweges. In Hinblick auf die Proliferation zeigten sich keine bedeutenden Unterschiede. Nach Röntgenbestrahlung wurde zudem kein einheitlicher EGFRvIII-abhängiger Effekt bezüglich der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen beobachtet, ein Mechanismus, der für das Überleben von Zellen nach Röntgenbestrahlung entscheidend ist. Hinsichtlich der Strahlenempfindlichkeit an sich wurde kein signifikanter Unterschied zwischen EGFRvIII−- und EGFRvIII+-Zellen beobachtet. Demzufolge konnte auch weder für EGFRvIII−- noch für EGFRvIII+-Zellen eine signifikante Radiosensitivierung durch eine EGFR-Inhibition mittels Gefitinib erreicht werden. Diese Daten deuten insgesamt an, dass anders als bisher vermutet eine endogene EGFRvIII-Expression keinen Einfluss auf die zelluläre Strahlenempfindlichkeit hat. Im Gegensatz zur Reaktion auf Röntgenbestrahlung konnte bezüglich einer Behandlung der Sub-Zelllinien mit TMZ erstmalig in einem endogenen und isogenen Modellsystem gezeigt werden, dass EGFRvIII+-Zellen im Vergleich zu EGFRvIII−-Zellen deutlich sensitiver sind. Dementsprechend wurde beobachtet, dass eine gezielte Herunterregulation des EGFRvIII mit einer gesteigerten Resistenz gegenüber TMZ einhergeht. Die zytotoxische Wirkung von TMZ wird in MGMT-negativen Zellen überwiegend durch intakte Mismatch Reparatur (MMR) vermittelt. In Übereinstimmung damit konnte gezeigt werden, dass in EGFRvIII-exprimierenden Zellen eine erhöhte Expression der MMR-Proteine vorliegt und eine gezielte Herunterregulation des EGFRvIII zu einer Reduktion des MMR-Proteins MSH6 führte. Als mögliche Ursache für die verstärkte MMR kann ein erhöhtes Level an Replikationsstress angenommen werden, wie durch Untersuchungen der Replikation mittels Fiber Assay in den EGFRvIII+-Zellen beobachtet werden konnte. In Übereinstimmung damit wiesen die EGFRvIII+-Zellen zudem schon in unbehandelten Zustand eine stärkere Phosphorylierung von Proteinen der DNA-Schadensantwort wie H2AX, Chk1, ATM und Chk2 auf. In dieser Arbeit konnte somit ein isogenetisches und nicht-gentechnisch verändertes Zellkulturmodellsystem bestehend aus verschiedenen EGFRvIII-positiven und -negativen Sub-Zelllinien etabliert werden, welches sich optimal eignet, um den Einfluss von EGFRvIII auf zentrale Aspekte der Biologie und Therapie von GBM-Zellen zu untersuchen. Mit Hilfe dieses Systems konnte erstmals gezeigt werden, dass eine endogene EGFRvIII-Expression nicht mit einer erhöhten Strahlenresistenz einhergeht und sich eine EGFR-Inhibition nicht für eine Radiosensitivierung eignet. Im Gegensatz dazu zeigte sich jedoch in den EGFRvIII+-Zellen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber TMZ. Dies kann auf eine gesteigerte MMR zurückgeführt werden, welche durch einen erhöhten Replikationsstress in den EGFRvIII+-Zellen ausgelöst zu sein scheint. Diese Ergebnisse sind deshalb von großer Bedeutung, da auch aktuelle klinische Studien zum einen eine Assoziation der EGFRvIII-Expression mit einer Radioresistenz nicht bestätigen konnten und zum anderen Ansätze zur EGFR-Inhibition nicht zu den gewünschten Erfolgen führten. Die Arbeiten zeigen aber auch, dass die EGFRvIII-Expression ein potentieller Biomarker für das effektive Ansprechen von MGMT-negativen GBM auf TMZ sein könnte.

The epidermal growth factor receptor EGFR is overexpressed in approximately 40-50% of glioblastomas (GBM), which is associated with egfr gene amplification. Additionally about 25-30% of these tumours display expression of the EGFR deletion mutant EGFRvIII. Pre-clinical studies, which used transfected cell cultures observed an association between EGFRvIII expression and increased resistance towards X-irradiation. Furthermore it was shown that EGFR inhibition leads to radiosensitiziation of cells, which were transfected with EGFRvIII. However, no clear association between EGFRvIII and resistance towards chemotherapeutics has been described so far. Until now it is not clear if EGFRvIII is a prognostic factor for the overall survival of GBM patients, who are treated with radio- and temozolomide (TMZ) based chemotherapy. For that reason in the present thesis the impact of EGFRvIII expression on cellular radiosensitivity with and without EGFR inhibition was analyzed. Furthermore the influence of EGFRvIII expression on TMZ sensitivity was determined. In this context O6-methylguanine-methyltransferase (MGMT) negative and EGFRvIII positive GBM cell lines were used to generate isogenetic sublines with either a very low (EGFRvIII−) or a very high fraction of EGFRvIII positive cells (EGFRvIII+). The characterization oft the EGFRvIII+ cells revealed only a moderate activation for the MAPK and AKT/PI3K signaling when compared to EGFRvIII− cells. In regard to proliferation no significant differences were recorded as well. Furthermore we observed no consistent EGFRvIII dependent effect in respect to DNA double strand break repair, which is crucial for the cellular survival after irradiation. Strikingly, no significant difference in cellular radiosensitivity was determined for either of the two pairs of EGFRvIII− and EGFRvIII+ sublines. This observation suggests that endogenous EGFRvIII expression has no impact on cellular radiosensitivity in these GBM cell lines. In agreement with this EGFR inhibition did not lead to a robust radiosensitization irrespective of the EGFRvIII status. In contrast to irradiation we were able to demonstrate that EGFRvIII+ compared to EGFRvIII− cells are highly sensitive towards TMZ and a knock down of EGFRvIII was associated with increased TMZ resistance. The cytotoxic effect of TMZ in MGMT negative cells is predominately determined by intact mismatch repair (MMR). In line with this we could show that EGFRvIII expressing cells display elevated MMR protein expression. As a consequence the specific knock down of EGFRvIII led to a reduction of the MMR protein MSH6. A possible explanation for the elevated MMR capacity in EGFRvIII+ cells is the presence of increased replication stress, which was analyzed by a fiber assay. This assay confirmed the hypothesis: increased replication stress was detected in EGFRvIII+ cells. In line with this untreated EGFRvIII+ cells displayed a higher phosphorylation of proteins H2AX, Chk1, ATM and Chk2 involved in DNA damage recognition. Taken together, in the present study a model system consisting of two pairs of isogenetic and not genetically modified EGFRvIII+ and EGFRvIII− sublines was established. This model system is an ideal tool to analyze the impact of EGFRvIII expression on central biological and clinical aspects of GBM cells. Based on this model system we could show, that endogenous EGFRvIII expression is not associated with increased radioresistance and that EGFR inhibition is not efficient for radiosensitization of EGFRvIII−/+ GBM cells. In contrast to these observations it was shown that EGFRvIII+ cells display an increased sensitivity towards TMZ. This is probably due to an enhanced MMR capacity, which seems to be the consequence of EGFRvIII induced replication stress. This data are of great importance because also recent clinical data did not confirm an association of EGFRvIII expression and radioresistance and EGFR inhibition did not lead to the clinical success, which was expected. In contrast it was demonstrated, that EGFRvIII expression leads to an increased sensitivity towards TMZ, which is presumably caused by an elevated replication stress. EGFRvIII might therefore be a potential biomarker for the effective inactivation of MGMT negative GBM tumours by TMZ.