DNA-basierte Methoden zur Differenzierung der ecuadorianischen Kakaosorten Arriba und CCN-51

Abstract

Der ecuadorianische Edelkakao Arriba wird vermutlich mit dem Konsumkakao CCN-51 gestreckt. Um die Reinheit edler Kakaoprodukte zu sichern, sind Methoden zur Differenzierung der beiden Kakaosorten notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese DNA-basiert entwickelt. In der plastidären DNA wird ein höherer Grad an Variabilität vermutet als im nukleären Genom. Ein Sequenzunterschied zwischen beiden Kakaosorten wurde daher im Chloroplastengenom gesucht. Dazu wurden umfangreiche Sequenzierungsarbeiten kompletter plastidärer Genome durchgeführt. Diese erfolgten mithilfe der von Kane et al., 2012 publizierten Methode low coverage whole genome shotgun sequencing, wodurch eine aufwendige Isolierung der Chloroplasten von den restlichen Zellbestandteilen entfiel. Nach einem Vergleich der Sequenzen beider Kakaosorten konnten Single Nucleotide Polymorphisms festgestellt werden. Basierend auf fünf SNPs wurden sechs PCR-RFLP-Methoden zur Unterscheidung der Sorten Arriba und CCN-51 entwickelt. Eine Sequenzierung der Inverted-Repeat-Region der beiden Kakaosorten entsprechend Dhingra et al., 2005 ergab eine unterschiedliche Wiederholung der fünfbasigen Sequenz (TAAAG)n. Eine Methode zur Differenzierung der beiden Kakaosorten bestand in einer Universal-PCR: Es ergeben sich Amplifikate verschiedener Größe für die Sorten CCN-51 (n = 14) und Arriba (n = 6), die mittels Agarosegelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese oder dHPLC detektiert werden. Mithilfe der entwickelten Verfahren wurde nachgewiesen, dass die als Probenmaterial dienenden Kakaobohnen teilweise bereits Mischungen beider Sorten waren. Der Verdacht, die Sorte Arriba würde mit CCN-51 gestreckt werden, wurde somit bestätigt. Beim CCN-51-Blattprobenpool traten Ausnahmen auf. Da es sich bei diesem Organismus um einen Klon handelt, sollten keine Sequenzunterschiede zu beobachten sein, wie es bei der Sorte Arriba, die sich sexuell reproduziert, vorkommen kann. Der Verdacht lag nahe, dass es innerhalb der Sorte CCN-51 mehrere Typen gibt. Mittels einer Mikrosatellitenanalyse wurde dieser Verdacht bestätigt.

The Ecuadorian fine cocoa type Arriba is presumed to be commonly adulterated with CCN-51, a bulk cocoa type. In order to ensure the purity of fine cocoa products from Ecuador, analytical methods for differentiation of the two are needed. In this project, DNA-based methods were developed and tested using leaf samples and cocoa bean samples. The plastid genome is assumed to be more variable than the nucleic genome of cocoa plants. Therefore, sequence variations in the plastid DNA were examined and extensive sequencing of the plastid genomes of both cocoa types was performed using low coverage whole genome shotgun sequencing. Unlike other methods, this method does not necessitate time-consuming isolation of the chloroplasts or a separation of the plastid DNA from other cell components (such as the nucleus or mitochondria). The comparison of the sequenced genomes returned only single nucleotide polymorphisms (SNPs). Using five SNPs, six PCR-RFLP methods for differentiation of the two cocoa types were developed. Additional sequencing of the plastid inverted repeat region revealed a difference in repeats of the five base sequence (TAAAG)n. Most Arriba samples possessed six repeats of the sequence, while most CCN-51 possessed fourteen repeats. This allowed the differentiation of the two cocoa types using PCR with universal primers and DNA fragment length analysis. Fragments were analyzed using agarose gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, or dHPLC. Amongst the CCN-51 leaf samples analyzed, some showed deviating results in the (TAAAG)n fragment analysis. These should not occur as CCN-51 is a clone, unlike Arriba, which reproduces sexually. This suggests that there are several different subtypes of CCN-51. Microsatellite analysis of the samples in question confirmed this suspicion. Application of the developed methods to cocoa bean samples showed that some of the sample material contained mixtures of both cocoa types. This confirmed the initial suspicion that Arriba cocoa is adulterated with CCN-51 cocoa.