Die posttranslationale Modifikation des humanen Tumor-Nekrose-Faktordurch ADP-Ribose

Abstract

Dem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) wird eine zentrale Rolle in der angeborenen und adaptiven Immunantwort zugeschrieben. Bisher ist wenig über die posttranslationale Modifikation dieses pleiotropen Zytokins bekannt. In vorgehenden Studien wurde gezeigt, dass humaner TNF durch humane ADP-Ribosyltransferase 1 (hART1) in vitro speziesspezifisch ADP-ribosyliert wird. Die ADP-Ribosylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation von Proteinen mit immunregulatorischem Effekt. Die ADP-Ribosegruppe wird von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) unter Freisetzung von Nikotinamid auf eine spezifische Akzeptoraminosäure des Zielproteins übertragen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden TNF und hART1 auf HEK293-Zellen exprimiert und die ADP-Ribosylierung von TNF mittels SDS-PAGE/ Autoradiographie untersucht. Dabei ließen sich Modifikationen sowohl der Stielregion (stTNF), als auch von löslichem TNF (sTNF) nachweisen. Einzelmutationen der 6 nicht konservierten Arginine (R) des sTNF (R82, R107, R120, R179, R207, R214) verhinderten weder die ADP-Ribosylierung von TNF in transmembranärer noch in löslicher Form. Auch Einzelmutationen unter Einbezug eines konservierten und eines nicht konservierten Arginins der Stielregion verhinderten nicht die ADP-Ribosylierung von stTNF und sTNF. Die vorliegende Dissertation zeigt, dass TNF mehrfach ADP-ribosyliert wird und jeweils mindestens eine ADP-Ribosylierungsstelle in der Stielregion (R60, R65) von TNF und sTNF (R82, R107, R120; R179, R207, R214) liegt. Diese Ergebnisse sind wichtige Grundlage zur Identifikation aller ADP-Ribosylierungsstellen in TNF und für weiterführende Studien bezüglich der Auswirkung der posttranslationalen Modifikation von TNF auf seine Bioaktivität und sein Bindungsverhalten zu seinen Rezeptoren.

TNF plays a central role in the innate and adaptive immune response. However, little is known about the posttranslational modification of this pleiotropic cytokine. Preexisting studies indicated, that in vitro human TNF is ADP-ribosylated by human ADP-ribosyltransferase 1 (hART1). ADP-ribosylation is a reversible posttranslational protein modification with an immuneregulatory effect, whereby the ADP-ribose moiety from nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is transferred to a specific acceptor amino acid of a target protein. In the context of this thesis TNF and hART1 were expressed on HEK293 cells , and the ADP-ribosylation of TNF by hART1 was analysed by SDS-PAGE/ Autoradiography. Modifications were found both in stalk region (stTNF) and in soluble TNF (sTNF). Single mutations of the 6 non-conserved arginines (R) of sTNF (R82, R107, R120, R179, R207, R214) did not prevent ADP-ribosylation. Similarly, single mutations including one conserved and one non-conserved arginine of the TNF-stalk did not completely prevent the modification. This thesis shows that TNF is ADP-ribosylated at multiple sites and that at least one ADP-ribosylation site is located in the TNF-stalk (R60, R65) and sTNF (R82, R107, R120; R179, R207, R214). These results are an important basis for the identification of all ADP-ribosylation sites in TNF and for continuing studies relating to the effects of the posttranslational modification of TNF to its bioactivity and its interaction with its receptors.