Der Einfluss von NS3, NS5A und Core des Hepatitis C Virus auf die Transformation proliferierender Hepatozyten

Abstract

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1. Einleitung 5 1.1 Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) 5 1.2 Hepatokarzinogenese 6 1.3 Telomerase, Telomere und ihre Rolle in der Hepatokarzinogenese 8 1.4 Das Hepatitis C Virus und seine Rolle in der Hepatokarzinogenese 10 1.4.1 Das Hepatitis C Virus (HCV) 10 1.4.2 HCV in der Hepatokarzinogenese 11 1.5 Modellsystem zur Untersuchung der HCV-assoziierten Hepatokarzinogenese 13 1.6 Zielsetzung 15

2. Material und Methoden 16 2.1 Material 16 2.1.1 Zelllinien 16 2.1.2 Expressionsplasmide 17 2.2 Methoden 18 2.2.1 Zellbiologische Methoden 18 2.2.1.1 Zellkultur 18 2.2.1.2 Propagierung von Expressionsplasmiden 20 2.2.1.3 Transfektion von FH-hTERT mittels Elektroporation 20 2.2.1.4 Gewinnung von Einzelzellklonen 22 2.2.1.5 Softagarassay 23 2.2.1.6 Proliferationsanalyse 24 2.2.1.7 Proliferationsanalyse in serumfreiem Zellkulturmedium 25 2.2.1.8 Nachweis von oxidativem Stress 25 2.2.2 Molekularbiologische Methoden 28 2.2.2.1 Plasmid-Präparation aus Bakterienzellen 28 2.2.2.2 DNA-Extraktion 28 2.2.2.3 RNA-Extraktion 29 2.2.2.4 cDNA-Synthese 29 2.2.2.5 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäureproben 30 2.2.2.6 Platinum-PCR 31 2.2.2.7 Agarosegelelektrophorese 32 2.2.2.8 Relative Quantifizierung der Transgen-Expression 33 2.2.2.9 Relative Quantifizierung der Expression von CDKN1A (p21) 35 2.2.3 Statistische Auswertung 36

3. Ergebnisse 37 3.1 Agarosegelelektrophorese 37 3.2 HCV-Transgen-Expression in FH-hTERT 38 3.3 Proliferationsanalyse 40 3.4 Proliferation in serumfreiem Zellkulturmedium 44 3.5 Oxidativer Stress 47 3.6 Relative Expression von CDKN1A (p21) 50 3.7 Verankerungsunabhängiges Wachstum 52

4. Diskussion 54 4.1 FH-TERT-Zellkultur als Modellsystem der Hepatokarzinogenese 54 4.2 Erzeugung stabil transfizierter FH-hTERT-Zellklone 55 4.3 Expression von HCV-Transgenen in stabil transfizierten Hepatozyten 56 4.4 Induktion von oxidativem Stress durch HCV-Proteine 57 4.5 DNA-Schadensantwort (Expression von p21) 60 4.6 Maligne Transformation durch den Einfluss von HCV-Proteinen 6