IDA - ein Integrin-spezifisches DNA-Aptamer

Abstract

Das heterodimere α6β4 Integrin ist ein großes Zelloberflächenprotein, das durch Bindung an Laminin-332 die Bildung von Hemidesmosomen einleitet und somit zu einer festen Adhäsion der Zelle an die extrazelluläre Matrix führt. Zudem spielt es durch seine signalgebenden intrazellulären Domänen eine wichtige Rolle bei der Migration von Zellen z.B. während der Wundheilung. Krebszellen, die das α6β4 Integrin ebenfalls präsentieren, nutzen diese durch Laminin-Bindung entstehenden Signalwege zur Förderung des Tumorzellwachstums und zur organotropen Metastasierung. Eine höhere Präsentation des Integrins auf Krebszellen führt so oft zu einer schlechteren Prognose von Tumorpatienten. Da somit die Blockierung der Integrin-Laminin-Interaktion von hohem therapeutischem Interesse ist, war das Ziel dieser Arbeit die Selektion α6β4 Integrin inhibierender Aptamere. Zunächst erfolgten zur Anreicherung von Nukleinsäuren für die native Konformation des Integrins fünf Zell-SELEX-Runden mit α6β4 Integrin präsentierenden Prostatakrebszellen (PC-3). Anschließend wurde zur Erhöhung der Spezifität der resultierenden Bibliothek eine konventionelle SELEX mit dem rekombinanten Integrin durchgeführt. Nach zwölf Selektionsrunden konnte eine gesteigerte Bindung der Bibliothek an PC-3-Zellen beobachtet werden und die anschließende Klonierung und Sequenzierung führte zu 20 Klonen, die allerdings keine Sequenzähnlichkeiten aufwiesen. Deshalb wurden alle erhaltenen Nukleinsäuren auf ihre Bindung an die PC-3-Zellen überprüft. Dabei zeigte die Nukleinsäure nc1228 die höchste Affinität zu den Zellen mit einer Dissoziationskonstante von 137 ± 22 nM. Diese Nukleinsäure wurde dann im Folgenden Integrin α6β4 spezifisches DNA Aptamer (IDA) genannt. Folgende Inhibitionsstudien zeigten dann, dass IDA die Bindung von PC-3-Zellen an Lamin-332 mit einer mittleren inhibitorischen Konzentration (IC50-Wert) von ~150 nM inhibierte. Die weitere Analyse zeigte zudem, dass IDA sowohl spezifisch an das humane als auch an das murine α6 Integrin gebunden hat. Zudem konnte mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie gezeigt werden, dass das Aptamer in die Zellen internalisiert wird. Die Halbwertszeit von IDA lag in murinem Plasma bei sechs Stunden. Deshalb erfolgte zur Verbesserung der Stabilität und Pharmakokinetik von IDA dessen Modifikation. Dabei führte der intramolekulare Einbau von Thionukleotiden zu einem Verlust der Bindung, während bei der 3‘-PEG-Modifikation die Bindung erhalten blieb. Die Analyse der Struktur ergab für IDA Stamm-Schleifen in B-DNA-Form, welche auch in Sekundärstrukturanalysen erkennbar waren. Davon ausgehend wurden zwei mögliche Verkürzungen ermittelt. Diese IDA-A und IDA-B (44 bzw. 36 nt) genannten Nukleinsäuren, waren zwar in der Lage, an die PC-3-Zellen zu binden, allerdings konnten sie die Integrin-Laminin-Interaktion nicht inhibieren.

The heterodimeric laminin receptor α6β4 integrin plays a central role in the promotion of tumor cell growth, invasion, and organotropic metastasis. As an overproduction of the integrin is often linked to a poor prognosis, the inhibition of α6β4 integrin binding to laminin is of high therapeutical interest. Therefore the aim of this study was the selection of α6β4 integrin inhibiting aptamers. To select a DNA aptamer specific for α6β4 integrin in its native state, a cell-SELEX approach was started using prostate cancer cells (PC-3). After five rounds of enrichment, a conventional SELEX approach was done by using the recombinant protein immobilized on magnetic beads. After 12 selection rounds, the enriched library showed an increased affinity towards PC-3 cells compared to the starting library. As this library showed an enrichment of binding species for ITGB4 knockdown cells as well, two libraries, the one from round 12 as well as from round 10, were cloned and sequenced. The results of the sequencing showed no enrichment of distinct species. Therefore all obtained nucleic acids were analyzed for their binding capacity. The highest affinity showed nc1228, which had a dissociation constant of 137 ± 22 nM. This nucleic acid was further termed Integrin α6β4 specific DNA Aptamer (IDA). The aptamer was further able to block the integrin-laminin-interaction with an apparent Ki of 123 ± 44 nM. The IC50-value was calculated to be around 150 nM. Instead of a complete loss of binding to ITGB4 knockdown cells, IDA showed a reduced binding. Therefore the specificity of IDA was determined by electrophoretic mobility shift assay using the human recombinant proteins α6β4, α6β1 and α4β1. IDA bound to both α6 Integrin, but not to α4β1. Furthermore IDA was able to bind the murine α6β4 and to be internalized into PC-3 cells as well. Cd-Spectroscopic analysis identified the structure of IDA as a B-DNA stem loop, whose formation is independent of different salt conditions. Via secondary structure predication it was possible, to identify 3 possible stem loops. These data was used for the truncation of IDA, whereas both constructs were able to bind PC-3 cells, but did not block the integrin-laminin-interaction. The half-life time of IDA in murine plasma was determined to be around 6 h. Therefore to increase the stability and pharmacokinetic modifications of IDA were produced. An intramolecular thiomodification led to a loss of binding, where as a 3’ pegylation retained its ability to bind to PC-3 cells.