Identification of trafficking determinants in novel PNEPs of the human malaria parasite Plasmodium falciparum

Abstract

The severest form of human malaria is caused by the protozoan parasite Plasmodium falciparum. This parasite multiplies within red blood cells which it remodels extensively to ensure its survival and virulence. A major cause of this parasite’s perilousness is the virulence factor PfEMP1, which is exported from the parasite and displayed on the red blood cell surface, where it mediates cytoadherence to the endothelium of blood vessels. Besides PfEMP1, the parasite exports a large number of other proteins into its host cell, the function of most of them still being unknown. Most known exported proteins contain a motif called PEXEL that mediates their export into the host cell. However, a growing number of PEXEL-negative exported proteins (PNEPs) is being identified and evidence suggests that these proteins might constitute a significant part of the P. falciparum exportome (all exported proteins). The PNEPs that were initially identified all lacked a signal peptide but contained a single transmembrane domain, mediating entry into the secretory pathway and an N-terminus essential for protein export. For PNEPs with other domain organizations, a group of PNEPs only recently identified, the trafficking determinants are unknown. This work aimed to elucidate the trafficking of these novel PNEPs, including those containing a classical N-terminal signal peptide or those with a signal peptide and a transmembrane domain. In all PNEPs containing only a signal peptide, the N-terminus after the signal peptide (mature N-terminus) was found to mediate export, similar to previously known PNEPs. In contrast, most regions in the PNEPs with a signal peptide and a transmembrane domain were required for export. This suggested a delicate combination of all domains was involved in the export of this so far rarest type of PNEP and that these proteins lacked a clear cut trafficking domain. This indicates common trafficking regions in most but not all of the different types of the presently known PNEPs. Interestingly, in one of the PNEPs with a signal peptide, called MSRP6, a region in the C-terminus independently of the mature N-terminus also mediated protein export. In addition this region was also necessary and sufficient for the recruitment of MSRP6 to the Maurer’s clefts, trafficking organelles within the infected red blood cell. Hence, this domain mediated both export and sorting in the host cell. To identify proteins that interact with this C-terminal part and could potentially explain both the Maurer’s cleft localization and protein export, proximity-dependent biotin identification (BioID) in combination with quantitative mass spectrometry was performed. In total, of 44 significant hits 33 were exported proteins. In this work, 11 proteins were endogenously tagged with GFP which confirmed a localization at the Maurer’s clefts for 10 of them. CoIP experiments then validated 5 proteins as MSRP6 interaction partners, indicative of a novel protein complex at the Maurer’s clefts. Together with the trafficking phenotype of MSRP6 these results could suggest that the MSRP6 protein complex, or some components of the complex, are assembled during early trafficking steps and trafficked together until their arrival at the Maurer’s clefts. The large fraction of Maurer’s clefts proteins identified among the significant hits also indicates that BioID can be a useful tool for proteome analyses in P. falciparum.

Plasmodium falciparum, ein einzelliger eukaryotischer Parasit, verursacht die gefährlichste Form der Malaria im Menschen. Der Parasit vermehrt sich in roten Blutkörperchen, die er während seiner Entwickung stark modifiziert um sein Überleben und seine Virulenz zu gewährleisten. Der Virulenzfaktor PfEMP1, der vom Parasiten in die Wirtszelle exportiert und dort auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen präsentiert wird, vermittelt Zytoadherenz der infizierten Zelle an das Endothel der Blutgefäße. Dies ist eine der Hauptursachen für die Gefährlichkeit dieses Parasiten. Neben PfEMP1 exportiert der Parasit noch eine große Anzahl von weiteren Proteinen, deren Funktionen häufig unbekannt sind in die Wirtszelle. Die meisten bekannten exportierten Proteine beinhalten ein sogenanntes PEXEL-Motiv, das den Export in die Wirtszelle vermittelt. In den letzten Jahren wurde allerdings eine wachsende Anzahl von PEXEL-negativen exportierten Proteinen (PNEPs) identifiziert, was darauf hindeutet, dass diese Proteine einen signifikanten Teil des Exportoms (alle exportierten Proteine) von P. falciparum ausmachen. Die ersten bekannten PNEPs besaßen kein Signalpeptid, sondern beinhalteten eine einzelne Transmembrandomäne, die den Eintritt in den sekretorischen Transportweg vermittelte und einen N-Terminus, der essenziell für den Export war. Der exportvermittelnde Teil in PNEPs mit anderen Domänen-Organisationen, die kürzlich entdeckt wurden, ist bis jetzt unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Transport-Determinanten dieser neuen PNEPs, die ein klassisches N-terminales Signalpeptid oder ein Signalpeptid und eine Transmembrandomäne beinhalten. In allen PNEPs, die nur ein Signalpeptid besaßen, wurde der nach Abspaltung des Signalpeptids entstehende N-Terminus als exportvermittelnd identifiziert, was der Situation in vorher bekannten PNEPs entspricht. Im Gegensatz dazu wurden fast alle Bereiche in PNEPs mit einem Signalpeptid und einer Transmembrandomäne für den Export benötigt. Dies deutet darauf hin, dass eine fragile Kombination aller Domänen am Export dieser bisher seltensten Art von PNEPs beteiligt war und diese kein scharf umrissenes Exportsignal besitzen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Export der meisten, allerdings nicht aller zur Zeit bekannten PNEPs, durch ähnliche Bereiche vermittelt wird. Neben der N-terminalen Exportregion im PNEP MSRP6 wurde interessanterweise noch eine weitere Region im C-Terminus ermittelt, die unabhängig vom N-Terminus auch Export vermittelte. Zusätzlich war diese Region notwendig und ausreichend um MSRP6 an die Maurer’s clefts (Organellen in der Wirtszelle, die für den Transport von vielen Proteinen an die Oberfläche des roten Blutkörperchens wichtig sind) zu rekrutieren. Somit vermittelte diese Domäne sowohl Export als auch die Sortierung in der Wirtszelle. Um Proteine zu identifizieren, die mit diesem C-terminalen Bereich interagieren und möglicherweise die Maurer’s clefts Lokalisation und auch den Proteinexport erklären könnten, wurde "proximity-dependent biotin identification" (BioID) in Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie eingesetzt. Insgesamt wurden damit 44 signifikante Treffer erzielt, wovon 33 exportierte Protein waren. Für diese Arbeit wurden 11 Proteine endogen mit GFP fusioniert, wodurch eine Maurer’s clefts Lokalisation für 10 dieser Proteine bestätigt wurde. Mit Hilfe von CoIP-Experimenten wurden 5 dieser Kandidaten als MSRP6 Interaktionspartner validiert, was auf einen neuen Proteinkomplex an den Maurer’s clefts hindeutet. Zusammen mit den Transport-Daten von MSRP6 könnte dies darauf hinweisen, dass der MSRP6-Proteinkomplex, oder Teile davon, in einem frühen Schritt des sekretorischen Weges zusammengefügt und die Komponenten zusammen transportiert werden, bis sie die Maurer’s clefts erreichen. Der hohe Anteil an Maurer’s clefts Proteinen unter den signifikanten Treffern deutet auch darauf hin, dass BioID ein nützliches Instrument für die Proteomanalyse in P. falciparum sein kann.