Structural Characterization of Cell Wall and Plasma Membrane Proteins of Arabidopsis thaliana

Abstract

The work performed during the period of this PhD project included methods to analyze the structures of AtGSLO5-IL, SAUL1 and selected ARM repeats with particular emphasis on the generation of soluble proteins within prokaryotic cells. Due to the fact that structural information of homologous proteins does not exist, my aim was to overexpress the respective genes, purify those proteins and determine their structures. Protocols for the expression and purification of the AtGSLO5-IL, SAUL1 and ARM 7-11 repeats proteins were successfully established. Hexahistidine and GST fusion tags allowed the successful purification of AtGSLO5-IL, SAUL1 and the ARM repeat protein in large quantities, supporting the solubility of the proteins. Mass spectrometry was used to identify AtGSLO5-IL, SAUL1 and ARM repeats. Dynamic light scattering (DLS) and circular dichroism (CD) data were also used to confirm and analyze the monodispersity, stability and the folding of the proteins respectively. Small angle X-ray scattering (SAXS) measurements for the AtGSLO5-IL, GST-SAUL1 fusion protein, SAUL1 and ARM 7-11 proteins were successfully performed, at the synchrotron source PETRA III, and analyzed enabling the elucidation of more structuraldetails. Moreover, electron microscopy (EM) data were collected for the AtGSLO5-IL and SAUL1 proteins, which allow obtaining complementary insights into the dimensions of the proteins.

Im Rahmen der Promotionsarbeit, wurden komplementäre biophysikalische Methoden eingesetzt, um die Strukturen von AtGSLO5-IL, SAUL1 und ausgewählten ARM Repeats zu analysieren, mit besonderem Schwerpunkt auf die Produktion von löslichen Proteinen in prokaryotischen Zellen. Aufgrund der Tatsache, dass bislang kein homologe Proteine Strukturen existieren, war mein Ziel, die entsprechenden Gene zu überexprimieren, zu reinigen und ihre Strukturen zu bestimmen. Protokolle für die Expression und Reinigung von AtGSLO5-IL, SAUL1 und ARM7-11 von SAUL1 wurden erfolgreich etabliert. Die Verwendung von Hexa-Histidin und GST-getaggten Proteinen erlaubte die erfolgreiche Reinigung von AtGSLO5-IL, SAUL1 und ARM7-11 in genügend großen Mengen. Durch Massenspektrometrie wurde die Identität von AtGSLO5-IL, SAUL1 und eines ARM Repeat-Proteins bestätigt. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Cirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) wurden auch verwendet, um die Monodispersität, die Stabilität und die Faltung derProteine zu bestätigen und zu analysieren. Röntgenkleinwinkelbeugungsmessungen (SAXS) für AtGSLO5-IL, GST-SAUL1, SAUL1 und das ARM 7- 11 Protein wurden an der Sychrotronsstrahlungsquelle PETRA III erfolgreich durchgeführt und analysiert, was die nähere Aufklärung von strukturellen Eigenschaften ermöglicht hat. Darüber hinaus konnten gesammelte Elektronenmikroskopie (EM)-Daten von AtGSLO5-IL und SAUL1 ergänzende Einblicke in die 2/ 3D-Struktur ermöglichen.