Einfluss von Argininen und Lysinen innerhalb des gp120 V3-loop von R5X4-dualtropen HIV-1- Mutanten auf den Tropismus des Virus

Abstract

HIV-1 benutzt die beiden Chemokinerezeptoren CXCR4 und CCR5 als zusätzliche Rezeptoren. Für die Therapie existieren Medikamente die den Weg über den CCR5 Cemokinrezeptors blockieren. Um diese Medikamente effektiv einsetzen zu können wird der Koerezeptor Typ des HIV-1 durch eine Sequenzierung des gp120 V3-Loops bestimmt. Zur Analyse der Sequenzen gibt es verschiedene Verfahren, ein Bestandteil jedes dieser Verfahren ist die 11/24/25-Regel. Diese Regel berücksichtigt die gesamte positive Ladung des V3-Loops welche sich aus der Summe der Ladungen der vier Aminosäuren Arg, Lys, Glu, und Asp ableitet. Dabei werden die unterschiedlichen chemischen Eigenschaften der beiden Aminosäuren Arg und Lys nicht berücksichtigt. Eine Frage war, inwieweit sich bei einem Wechsel von Arg nach Lys die Infektiosität oder der Tropismus des HIV-1 ändert. Es wurden daher basierend auf dem retroviralen Vektor NL4-3BSt 24 Virusvarianten hergestellt die an der V3-Loop Position 304-306 alle Kombinationen von Arg und Lys zeigen und sich außerdem in der Anzahl von N-Glycosylierungsstellen unterscheiden. Die acht möglichen KKK>RRR Kombinationen wurden in drei verschiedene Viren NL-952.1, NL-952.2 (-g15), NL-952.3 (-g13/14/15/17) kloniert. Zusätzlich zu den acht KKK>RRR Varianten wurden weitere neun Virusvarianten zu Vergleichszwecken hergestellt die Aminosäuren trugen die an der V3 Loop Position 304-306 bei dem Subtyp B des HIV-1 am häufigsten vorkommen. In Infektionsstudien mit definierten CD4 und Korezeptor positiven Zelllinien (Ghost, U87 und TZM-bl) wurden alle Virusmutanten auf ihre Infektionseffizienz untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die RRR-Mutanten deutlich effizienter infizierten als die KKK-Mutanten. Das infektiöseste Virus hatte die 304-306 Sequenz RRR und die schwächsten Infektionsraten hatten die Viren mir der KKK- SKK- und KTK-Sequenz. Weitere Unterschiede bezüglich der Infektiosität wurden in Neutralisationstests durch Zugabe der Korezeptor-Liganden SDF-1α und RANTES beobachtet. Dabei zeigte sich, dass RRR-Mutanten besser neutralisiert wurden, als KKK-Mutanten. Zusätzliche Neutralisiationsstudien mit einem gp120 bindenden Hemmstoff (mHSA) zeigte die gleichen Ergebnisse. Auch hier wurden die KKK-Mutanten verglichen mit den RRR-Mutanten schwerer neutralisiert. Für das N-Glycans g15 wurde gezeigt, dass es den Korezeptorwechsel von R5X4 dualtrop nach X4 monotrop bewirkt. Insgesamt wurde die unterschiedliche Wirkung der Aminosäuren Arg und Lys an den Positionen 304-306 auf die Infektiosität des HIV-1 gezeigt. Damit ist es möglich die bestehenden Regeln und Computer-Algorithmen zur Korezeptorvorhersage zu verbessern. Eine weitere Methode zur vergleichenden Analyse der Infektionseffizienz wurde mit Hilfe von löslichem gp120 entwickelt. Damit konnte ein Einfluss des gp120 sowohl auf die CXCR4-spezifische als auch die CCR5-spezifische Infektion gezeigt werden. So steigert lösliches gp120, einer effizient replizierenden RRR-Mutante, die Infektion einer schwächer replizierenden KKK-Mutante solange sich auf den Wirtszellen Heparansulfat-Proteoglycane befinden. In Abwesenheit von HSPG kehrt sich dieser Effekt in eine wirkungsvolle Neutralisation des KKK-Virus um. Keinen Einfluss auf die Infektiosität des RRR Virus hatte das KKK gp120. Ein neuer, bisher unbeobachteter Aspekt war, dass gp120 einer X4-tropen Virusmutante die Infektiosität eines R5-tropen Virus steigert. Dieses Ergebnis hilft die Wechselwirkung von unterschiedlichen Viren der HIV-1 Quasispezies hinsichtlich der Selektion und gegenseitigen Beeinflussung bei der Wechselwirkung mit den Rezeptoren auf Zelloberflächenbesser zu verstehen