S100A4 als Zielprotein der E3-Ligase Asb2β

Abstract

Die hypertrophe Kardiomyopathie ist die häufigste monogenetische Herzerkrankung und führt wegen des erhöhten Risikos für plötzlichen Herztod und bei Vorliegen einer Ausflusstraktobstruktion oft schon in jungen Jahren zu massiven Einschränkungen des alltäglichen Lebens. Obwohl bereits sehr viele zu HCM führende Mutationen bekannt sind, ist die Pathogenese der Erkrankung noch immer nicht vollständig verstanden und es fehlen kausale Behandlungsmöglichkeiten. Das Ubiquitin-Proteasom-System, das für einen Großteil des intrazellulären Proteinabbaus verantwortlich ist, scheint eine zentrale Rolle bei der Entstehung der HCM einzunehmen. Innerhalb des UPS katalysieren E3-Ligasen die entscheidende Reaktion und stellen so sicher, welche Proteine dem proteasomalen Abbau zugeführt werden. In einem Mybpc3-KI Mausmodell der HCM wurde eine Herunterregulation der E3-Ligase Asb2β festgestellt, so dass Asb2β und seine potenziellen Zielproteine in den Fokus unserer Arbeitsgruppe gelangt sind. Zuvor konnten mit Filamin B und Desmin bereits zwei Strukturproteine des Sarkomers bzw. des Cytoskeletts als Reaktionspartner von Asb2β identifiziert werden. Ziel dieser Arbeit war die Validierung von S100A4 als neuem Interaktionspartner von Asb2β und darüber hinaus die funktionelle Charakterisierung von S100A4 in künstlichem Herzgewebe. Weiterhin wurde die Genexpression von Asb2β und S100A4 in verschiedenen Grundlagenmodellen kardialer Erkrankungen untersucht. Die wichtigsten gewonnen Ergebnisse waren: 1. Trotz der verstärkten Aktivität des UPS in neonatalen Mybpc3-KI HCM-Mäusen zeigte sich in jungen und adulten Mybpc3-KI Mäusen eine niedrigere Asb2β-mRNAKonzentration als in WT Tieren. 2. Im Lamin-Mausmodell mit dem Phänotyp einer dilatativen Kardiomyopathie und zwei EHT-Modellen für pathologische Hypertrophie zeigten sich höhere S100A4-mRNAKonzentrationen als in den Kontrollgruppen, während im Mybpc3-KI Mausmodell niedrigere S100A4 mRNA-Konzentration festgestellt wurden. 3. Im Co-Transfektions-Assay zeigte sich, dass die S100A4 steady-state Proteinkonzentration durch Co-Transfektion mit Asb2β WT niedriger als mit Asb2β Mut war. Die Stabilisierung von S100A4 durch Zugabe des UPS-Inhibitors Epoxomicin bewies, dass der Abbau von S100A4 im Proteasom stattfindet. 4. Eine starke Überexpression von S100A4 wirkte sich negativ auf Kraft, Kontraktionsund Relaxationsgeschwindigkeit im Modell des künstlichen Herzgewebes aus. Trotz vieler neuer Erkenntnisse bleibt abschließend festzustellen, dass für einen sicheren Nachweis von S100A4 als Zielprotein von Asb2β weitere Versuche folgen müssen. Sollten keine Antikörper-Bedingungen für endogenes S100A4 gefunden werden, wäre eine Co-Immunopräzipitation mit und ohne UPS-Inhibierung nach Co- Transfektion eine geeignete Alternative. Die Rolle von S100A4 in der komplexen Pathogenese der hypertrophen Kardiomyopathie sollte bei der zukünftigen Erforschung dieser Krankheit nicht außer Acht gelassen werden.

Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most common monogenetic cardiac disease. Together with left outflow tract obstruction its increased risk for sudden cardiac death leads to a significant reduction in the qualitiy of life even in younger individiduals. Although many mutations responsible for the developement of HCM have been identified, its pathogenesis is yet to be understood completely and causal therapeutic options are unavailable. The Ubiquitin-Proteasom-System degrades the major part of all synthesized proteins and plays a pivotal role in the developement of HCM. Within the UPS E3-Ligases catalyse the final reaction of the ubiquitination and thereby ensure subtrate-specificty. An E3-Ligase called Asb2β has been found to be downregulated in Mybpc3-KI mice, an animal model of HCM. Therefore potential targets of Asb2β have gained our attention. Previously two sarcomeric proteins Filamin B and Desmin had been identified as targets of Asb2β. Aim of this study was the validation of S100A4 as a novel target of Asb2β followed by its functional effect on engineered heart tissue (EHT). Moreover mRNA-levels of S100A4 and Asb2β were analysed in different models of cardiac disease. In summary the results were: 1. Although the UPS in neonatal Mybpc3-KI mice is generally upregulated, Asb2β-mRNAlevels were found to be decreased in young and adult Mybpc3-KI mice compared to wild type controls. 2. In these mice S100A4-mRNA-levels were found to be decreased. Other cardiac disease-models such as DCM-mice or pathologically hypertophied EHTs contained higher S100A4-mRNA-levels. 3. Co-transfection of Cos-7-cells with S100A4 and a dysfunctional Asb2β mutant lead to higher expression levels of S100A4 protein when compared to co-transfection with Asb2β wild type. Adding of the UPS-inhibitor epoxomycin diminished (?) this effect and lead to stabilization of S100A4, proving the degradation of S100A4 happened in the UPS. 4. Strong adeno-associated viral overexpression of S100A4 in EHT lead to significanlty attenuated force developement as well as contraction and relaxation velocity. Though this study yielded strong evidence for the Asb2β-mediated degradation of S100A4 in the UPS, more experiments should follow for definite proof. Until a good antibody signal for endogenous S100A4 is found, co-immunoprecipitation in cotransfected samples with and without UPS-inhibition are likely to produce clarifying results. S100A4 should not be overlooked when researching HCM in the future.