Proteomic and Microscopic Analysis of Lipid Droplets and Associated Proteins in Hepatitis C Virus-infected Cells

Abstract

Lipid droplets (LDs) are dynamic cytoplasmic organelles mainly functioning as intracellular lipid reservoirs providing the cell with energy. They consist of a hydrophobic core of cholesterol esters and triglycerides, surrounded by a phospholipid monolayer and LD-associated proteins. LDs are essential for HCV replication, acting as viral assembly platforms. However, if and how HCV changes the LD proteome in order to create an environment suitable for viral assembly is still poorly understood. In this thesis a quantitative LD proteome analysis of HCV-infected hepatoma cells was performed to identify proteins that act as host factors for HCV replication. Using this approach, several proteins significantly enriched in or depleted from LD fractions of HCV-infected cells were identified. One of the proteins highly enriched in LD-fractions of HCV-infected cells was the phospholipid-binding protein Annexin A3 (ANXA3). Experimental analysis showed that ANXA3 was recruited to LD-associated membranes by the viral proteins core and NS5A. Silencing of ANXA3 severely impaired viral replication. However, early events of the viral life cycle were not affected by ANXA3-knockdown, suggesting that ANXA3 acts on viral assembly or maturation. ANXA3 influenced the secretion of apolipoprotein (Apo) E as well as the interaction between the viral envelope protein E2 and ApoE or E2 and viral core protein in HCV-infected cells. Silencing of ANXA3 reduced lipoviroparticle (LVP) infectivity accompanied by an increase in LVP density. Interestingly, ANXA3 was not needed for ApoE secretion in naïve cells, indicating that lipoprotein secretion is different in HCV-infected cells. Immunofluorescence analysis revealed mislocalization of ApoE in HCV-infected cells that correlated partially with fragmentation of the Golgi apparatus, both of which were prevented by silencing of ANXA3. This indicates that ANXA3 contributes to an HCV-induced Golgi fragmentation and directly or indirectly to the secretion of ApoE and maturation of LVPs. Thus, ANXA3 was identified as a HCV host factor, regulating viral particle production. Furthermore, the spatial distribution of viral proteins close to LD was analyzed by multicolor super resolution microscopy. Viral genomes were modified to express a Flag-tagged version of E2. Using these viral strains, three color direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) analyses of core/NS5A and Flag-E2 at LDs were performed, allowing reconstruction and analysis of putative viral assembly events in 3D. In summary, a quantitative LD proteome analysis of HCV-infected hepatoma cells was performed for the first time. Thereby, novel HCV host factors were identified and characterized. Moreover, putative viral assembly sites were visualized by super-resolution microscopy. Thus, this thesis provides new insights that contribute to a better understanding of the HCV assembly process.

Lipid droplets (LDs) sind zytoplasmatische Organellen, welche als intrazelluläre Fettspeicher hauptsächlich der Energieversorgung der Zelle dienen. LDs bestehen aus einem hydrophoben Kern, der sich aus Triglyceriden und Cholesterolestern zusammensetzt und von einer einfachen Phospholipidschicht sowie LD-assoziierten Proteinen umgeben ist. LDs spielen im Lebenszyklus des Hepatitis C Virus (HCV) eine essentielle Rolle, da sie als virale Assemblierungsplattform fungieren. Ob und inwiefern HCV eine Änderung in LD-assoziierten Proteinen hervorruft, um die Assemblierung neuer HCV Partikel zu ermöglichen, ist bisher noch nicht genau verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine quantitative LD Proteomanalyse von HCV infizierten Hepatomzellen durchgeführt, um neue Wirtsfaktoren der HCV Replikation zu identifizieren. Mittels dieses Ansatzes wurden Proteine identifiziert, die abhängig von der viralen Infektion signifikant an LDs angereichert oder reduziert waren. Eines der signifikant angereicherten Proteine war das Phospholipid-bindende Protein Annexin A3 (ANXA3). ANXA3 wurde durch die viralen Proteine Core und NS5A an LD-assoziierte Membranen rekrutiert. Der shRNA-vermittelte knockdown von ANXA3 führte zu einer starken Reduktion der viralen Replikation. Frühe Phasen der Infektion wurden nicht beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass ANXA3 an den späten Schritten während des Zusammenbaus oder der Reifung von HCV Partikeln beteiligt ist. In HCV-infizierten Zellen beeinflusst ANXA3 die Sekretion von Apolipoprotein (Apo) E, ebenso wie die Interaktion des viralen Hüllproteins E2 mit ApoE oder dem viralen Core Protein. ANXA3- knockdown-Zellen bildeten Viruspartikel mit geringerer Infektiösität, die gleichzeitig eine höhere Dichte aufwiesen. Interessanterweise scheint die Sekretion von Lipoproteinen in nicht infizierten Zellen unabhängig von ANXA3 zu sein, was darauf hindeutet, dass sich die Lipoproteinsekretion in HCV infizierten Zellen maßgeblich von der in nicht infizierten Zellen unterscheidet. Im Vergleich zu naiven Zellen zeigten Immunofluoreszenz-Analysen von HCV-infizierten Zellen eine Mislokalisierung von ApoE, die mit einer Fragmentierung des Golgi Apparates korrelierte. Beides wurde entscheidend durch ANXA3 beeinflusst, da die Reduktion der ANXA3 Expression die Golgi Fragmentierung in HCV infizierten Zellen größtenteils verhinderte und ApoE wieder innerhalb des intakten Golgi Apparats detektiert wurde. Das lässt den Schluss zu, dass ANXA3 direkt oder indirekt zum Transport von ApoE und der Reifung viraler Partikel während einer HCV Infektion beiträgt. Somit konnte ANXA3 als HCV Wirtsfaktor identifiziert werden, welcher maßgeblich an der Bildung infektiöser viraler Partikel beteiligt ist. Darüber hinaus wurde die räumliche Verteilung von viralen Proteinen an LDs mittels super-resolution Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Hierfür wurden Virus-Konstrukte hergestellt, die ein Flag-markiertes E2 Protein tragen. Mit diesen modifizierten Viren konnten direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) Aufnahmen der viralen Proteine Core oder NS5A, welche mit Flag-E2 an LDs kolokalisieren, generiert werden. Mögliche virale Assemblierungsprozesse wurden anhand dieser Aufnahmen dreidimensional dargestellt. Zusammenfassend wurde erstmals eine quantitative LD Proteomanalyse von HCV infizierten Hepatomzellen durchgeführt. Hierdurch konnten neue HCV Wirtsfaktoren identifiziert und charakterisiert werden. Zusätzlich konnten mögliche HCV Assemblierungsprozesse anhand einer super-resolution Mikroskopietechnik visualisiert werden. Somit leistet diese Dissertation einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis des HCV Assemblierungsprozesses.