Taxonomic and functional diversity of nitrifying biofilm communities in biofilters of different recirculating aquaculture systems

Abstract

Recirculating aquaculture systems (RAS) are an ecological and efficient way of fish farming with potentially minimal environmental impact. The removal of excreted toxic ammonia andnitrite is carried out by nitrifying chemolithoautotrophic microorganisms. Nitrification takes place in biological filters, inside these biofilters ammonia and nitrite oxidizing bacteria (AOB and NOB) colonize biocarriers, forming dense biofilms together with heterotrophic bacteria. In this study, biofilters of three different RAS operated with either freshwater, brackish or marine process water, have been investigated with the goal of characterizing and comparing the microbial biofilm communities. Three biofilters at each RAS have been sampled. RNA and DNA extracted from biofilms was used as the template for amplicon sequencing using Illumina MiSeq. Sequencing the V4 region of the 16S rRNA gene revealed a high microbial diversity with on average 1000-2500 operational taxonomic units (OTUs) found in each sample. The highest diversity was identified in the brackish samples. A low shared richness of 332 (RNA) and 270 (DNA) OTUs was found among the three plants, indicating different community structures and hence, site specific microbial communities. In all three RAS Proteobacteria was the predominant phylum, which contributed to 24-77 % of the total reads, followed by members of the phyla Bacteroidetes, Planctomycetes, Chloroflexi and Nitrospirae. Although on the genus level >50 % of all OTUs was assigned to uncultured bacteria, 674 known bacterial genera were identified in total. 85 and 76 genera were found to be shared between all samples in the RNA and DNA pools, respectively. Among these core-taxa, the nitrifying bacteria Nitrosomonas and Nitrospira as well as heterotrophs such as Rhodobacter, Planctomyces and Lewinella were frequently found. Comprehensive analysis of nitrifiers revealed site specific AOB and NOB communities at each RAS, mainly composed of uncultured representatives of the genera Nitrosomonas and Nitrospira. Amplicon sequencing of the amoA gene of β-proteobacterial AOB and the nxrB gene of Nitrospira-like NOB using Illumina MiSeq confirmed the results of the 16S rRNA amplicon approach by revealing a co-existence of different, closely related uncultured members of Nitrosomonas and Nitrospira in the biofilms. This strongly indicates that several potentially novel AOB and NOB species are present in RAS biofilters. A metagenomic approach using Illumina NextSeq revealed putative genes encoding for all necessary enzymes involved in nitrification and denitrification. Moreover, taxonomic assignment of nitrogen removal genes suggested that members of the identified predominant phyla (Proteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Nitrospirae) act as key players in nitrogen removal processes inside the biofilms. Furthermore, the metagenomic data sets gave evidence for the presence of comammox in the biofilms of the freshwater and brackish samples. Batch-experiments designed to investigate the impact of the substrate concentration, nitrate and salt stress on nitrification activity with colonized biocarriers derived from three different RAS showed distinctly different, characteristic physiological properties of each nitrifying community. The freshwater AOB showed the highest tolerance to rising ammonium concentrations among the samples, while the freshwater NOB were sensitive to increased nitrite levels. In contrast to the freshwater NOB, the brackish and marine NOB were more tolerant to nitrite related stress. The AOB communities were shown to be highly tolerant towards nitrate, while the NOB slowed down their nitrite oxidation activity in dependence on increasing nitrate concentrations. Salt tolerance tests showed that nitrification performance of freshwater nitrifiers was drastically reduced with increasing salinity, while the brackish and marine nitrifiers showed a high robustness and maintained nitrification activity in a broad range of salt concentrations. Competitive in situ studies via FISH-MAR with NOB enrichment cultures originally inoculated with biofilm material derived from a freshwater RAS showed that both, Nitrotoga and Nitrospira, were metabolically active when incubated in medium with either pH 6.4 or 7.2 at 14°C under short-term conditions. Nevertheless, it was assumed that in the long-term, under conditions with a slightly acidic pH-value in combination with low temperature, Nitrotoga can outcompete Nitrospira, which is of importance for the biofiltration performance in RAS operated under such conditions. To conclude, the data obtained in this study provided a deep insight into the microbial community compositions and structures as well as their potential in nitrogen removal processes in biofilms. With the knowledge gained of the physiological plasticity of nitrifiers inhabiting the biofilms, this data is useful for RAS operators and may facilitate optimization of system operation strategies.

In Kreislaufsystemen (Recirculating aquaculture system, RAS) wird das Haltungswasser über Wasseraufbereitung gereinigt und in die Haltungsbecken zurückgeleitet. RAS zeichnen sich durch einen geringen Wasserverbrauch aus und ermöglichen eine ökologische und umweltfreundliche Fischzucht. Von den Fischen ausgeschiedenes toxisches Ammoniak wird von nitrifizierenden chemolithoautotrophen Mikroorganismen entfernt. Dieser Nitrifikationsprozess findet in Biofiltern statt, in denen Ammoniak und Nitrit oxidierende Bakterien (AOB und NOB) zusammen mit heterotrophen Bakterien auf Trägermaterialen (Füllkörper) Biofilme bilden. In dieser Studie wurden Biofilter aus drei unterschiedlichen RAS beprobt, die entweder mit Süßwasser, Brackwasser oder Salzwasser betrieben werden, mit dem Ziel, die mikrobiellen Gemeinschaften zu charakterisieren und zu vergleichen. An jeder RAS wurden jeweils drei Biofilter beprobt und aus dem Biofilm extrahierte RNA und DNA als Template für eine Amplicon-Sequenzierung mittels Illumina MiSeq eingesetzt. Die Sequenzierung der V4-Region des 16S rRNA Gens erzielte eine hohe bakterielle Diversität mit durchschnittlich 1000-2500 Operational Taxonomic Units (OTUs), wobei die höchste Diversität in den Brackwasser-Proben vorherrschte. Es wurden lediglich 332 (RNA) und 270 (DNA) gemeinsame OTUs gefunden, was auf Habitat-spezifische bakterielle Gemeinschaften hindeutet. In allen drei RAS waren Proteobacteria am häufigsten vertreten (24-77 % der Gesamt-Sequenzen), gefolgt von Vertretern der Phyla Bacteroidetes, Planctomycetes, Chloroflexi und Nitrospirae. Die Mehrheit der OTUs auf Gattungs-Ebene (>50 %) wurde unkultivierten Bakterien zugeordnet. Innerhalb der 674 identifizierten bekannten Gattungen waren 85 (RNA) und 76 (DNA) als gemeinsame Vertreter in allen Proben zu finden. Unter diesen „Core-Taxa“ waren die nitrifizierenden Bakterien der Gattungen Nitrosomonas und Nitrospira und Heterotrophe wie Rhodobacter, Planctomyces und Lewinella häufig vertreten. Die umfassende Diversitäts-Analyse der Nitrifikanten wies für jede RAS eine Habitat-spezifische AOB- und NOB-Gemeinschaft auf, welche überwiegend aus unkultivierten Vertretern von Nitrosomonas und Nitrospira bestand. Die weiterführende Amplicon-Sequenzierung der amoA und nxrB Gene erwies eine Co-Existenz von unterschiedlichen, nahverwandten und unkultivierten Vertretern von Nitrosomonas und Nitrospira, was bestätigt, dass in den Biofilmen viele neue AOB- und NOB-Spezies zu finden sind. Die Metagenom-Sequenzierung mittels Illumina NextSeq zeigte, dass putative Gene, die für alle notwendigen Enzyme der Nitrifikation und Denitrifikation kodieren, im Biofilm vorhanden sind. Darüber hinaus konnte Vertretern der identifizierten vorherrschenden Phyla (Proteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Nitrospirae) eine potentielle Schlüssel-Rolle im Prozess der Stickstoffentfernung im Biofilm zugeschrieben werden. Desweiteren erwiesen die metagenomischen Daten das Vorkommen von potentiellen comammox Organismen in den Biofilmen der Süßwasser und Brackwasser RAS. Substrat-, Nitrat- und Salz-Toleranztests mit bewachsenen Füllkörpern aus den drei RAS zeigten unterschiedliche, charakteristische Eigenschaften der Nitrifikanten. Die Süßwasser-AOB erwiesen die höchste Toleranz gegenüber steigenden Ammoniumkonzentrationen, wohingegen die Süßwasser-NOB sensitiv gegenüber erhöhten Nitritkonzentrationen waren. Im Gegensatz zu den Süßwasser-NOB waren die Brackwasser- und Salzwasser-NOB jedoch toleranter gegenüber Nitrit. Die AOB-Gemeinschaften erwiesen sich als sehr unempfindlich gegenüber Nitrat, während die NOB in Abhängigkeit von der Nitratkonzentration ihre Nitritoxidation herabsetzten. Salztoleranztests zeigten eine signifikante Reduzierung der Nitrifikationsleistung der Süßwasser-Nitrifikanten mit zunehmender Salinität, wohingegen die Brack- und Salzwasser-Nitrifikanten sich als sehr robust herausstellten und die Nitrifikation in einem breiten Spektrum an Salinitäten aufrecht erhielten. Kompetitive Experimente via FISH-MAR mit einer NOB-Anreicherungskultur, die ursprünglich mit Biofilm-Material aus einer Süßwasser-RAS angeimpft wurde, zeigten, dass beide NOB, Nitrotoga und Nitrospira, in Medium mit pH 6.4 und 7.2 bei 14°C metabolisch aktiv sind. Dennoch wurde angenommen, dass auf längere Sicht, unter Bedingungen mit einem leicht saurem pH-Wert und niedriger Temperatur, Nitrotoga Nitrospira überwachsen kann. Die Daten dieser Studie geben einen tiefen Einblick in die Struktur und Diversität mikrobieller Gemeinschaften und deren potentielle Funktionen im Prozess der Stickstoffentfernung im Biofilm. Mit dem gelernten Wissen über die physiologische Plastizität der im Biofilm lebenden Nitrifikanten können die Daten helfen, den Biofiltrations-Prozess in RAS zu optimieren.