Charakterisierung von oligomeren Kakao-Proanthocyanidinen : Extraktion und chromatographische Trennung mit simultaner Bestimmung der antioxidativen Kapazität

Abstract

Kakaobohnen sind reich an phenolischen Substanzen, insbesondere an oligomeren und polymeren Proanthocyanidinen (PA), die bis zu 60% des Gesamtpolyphenolgehaltes im Kakao ausmachen. Die antioxidative Aktivität von monomeren Flavan-3-olen ist hinreichend bekannt, wobei es aber immer noch ein herausforderndes Thema ist, wenn es um die Bestimmung der antioxidativen Kapazität von oligomeren oder polymeren PA geht. Trotz des hohen wissenschaftlichen Interesses sind oligomere Kakao-PA mit einem Polymerisationsgrad (PG) = 4 entweder teuer oder mit einem PG = 5 nicht kommerziell zu erwerben. Im ersten Teil der Arbeit wurde mittels schonender Extraktion, ein polyphenolreicher Kakaoextrakt aus der Matrix extrahiert. Hierfür wurde mittels eines kolorimetrischen Assays hinsichtlich des Extraktionslösungsmittels, der Extraktionstemperatur und dem Probe-zu- Lösungsmittel-Verhältnis eine Optimierung vorgenommen. Es konnte gezeigt werden, dass mittels 50%igem Aceton-Wasser-Gemisch, bei einer Extraktionstemperatur von 50 °C im Verhältnis 1:3 ein bestmögliches Ergebnis erreicht wurde. Der so gewonnene Polyphenolreiche Kakaoextrakt wurde im darauffolgenden Schritt mittels zentrifugaler Gegenstromverteilungschromatographie (engl. sequential centrifugal partition chromatography, SCPC) und dem Lösungsmittelsystem Ethylacetat-n-Butanol-Wasser (4/1/5, v/v/v) ein System zur Fraktionierung und Aufreinigung des gefriergetrockneten Kakaoextraktes geschaffen, welches es ermöglicht, die beiden Alkaloide Theobromin und Koffein von einer Proanthocyanidinreichen Fraktion abtrennen zu können. Für die weitere Isolierung einzelner PA wurde die Proanthocyanidinreiche Fraktion in eine Gelpermeationssäule gefüllt, mit Sephadex LH-20 injiziert und in einer sequentiellen Elutionsreihenfolge mittels Aceton-Wasser-Gemisch in seine individuellen PA aufgetrennt. Aus 40 mg der Proanthocyanidinreichen Fraktion konnte so ein Gemisch aus 5,6 mg von (+)-Catechin und Proanthocyanidin B2, 2 mg von Proanthocyanidin C1 und einem weiteren unbekannten Dimer und 2 mg des tetrameren Cinnamtannin A2 gewonnen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde darüber hinaus mittels Normalphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und postchromatographischer Derivatisierung über 2,2-Diphenyl-1-pikrylhydrazyl (NP-HPLC-online-DPPH) eine Methode etabliert, welche es erlaubt, sowohl oligomere PA als auch die dazugehörige antioxidative Kapazität der Oligomere oder Oligomerfraktionen simultan zu messen. Durch das NP-HPLC-online-DPPH Assay konnten die oligomeren PA in ihre homologe Reihe angefangen vom Polymerisationsgrad (PG) PG = 1 bis PG = 13 getrennt und detektiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die antioxidative Kapazität mit steigender homologer Reihe zunimmt, wobei das PA mit einem PG = 9 die höchste antioxidative Kapazität besitzt. Die antioxidative Kapazität bewegt sich nicht linear mit dem PG, sondern fällt mit dem Erreichen der polymeren PA-Struktur, wobei bei PA mit einem PG > 13 die antioxidative Kapazität wieder abnimmt. Nichtcharakterisierte polymere PA wurden im Chromatogramm als ein breiter Hügel detektiert, welcher sich von der Basislinie abhebt und zum Ende des Chromatogramms eluiert. Bei diesem Hügel handelt es sich um PA mit einem PG > 13. Der sogenannte ‘PA-Hügel’ mit seiner komplexen Zusammenstellung von Polyphenolen besitzt durch seine quantitative Menge zwar eine hohe antioxidative Aktivität aber nur eine geringe spezifische antioxidative Kapazität. Die etablierte Polyphenolfraktionierung und -analytik wurde entlang des Schokoladenherstellungsprozesses angewandt, um Änderungen des Polyphenolgehaltes zu verfolgen. Hierbei verdeutlicht ein im Labormassstab durchgeführter Schokoladenherstellungsprozess die Änderung des Polyphenolprofils angefangen von der (1) rohen und frischen Kakaobohne, über die (2) fermentierte getrocknete Kakaobohne, zu der (3) gerösteten Kakaomasse, (4) 1 h conchierten Kakaomasse, (5) 4 h conchierten Kakaomasse bis hin zur (6) eingetafelten Schokolade. Hierbei wurde festgestellt, dass der Gesamtproanthocyanidin Gehalt PG1 - PG13 von 30 mg (-)-Epicatechinäquivalente pro Gramm fettfreier Trockenmasse in rohen frischen Kakaobohnen auf 5 mg (-)-Epicatechinäquivalente in der finalen Schokolade abfällt. Die antioxidative Aktivität fällt dementsprechend von 25 mg (-)-Epicatechinäquivalente pro Gramm fettfreier Trockenmasse in den rohen frischen Kakaobohnen auf 4 mg (-)-Epicatechinäquivalente in der finalen Schokolade. Insgesamt wurde während der Fermentation eine Verschiebung des Polyphenolprofils von oligomeren PA zu polymeren PA beobachtet, wobei oligomere PA bedingt durch die Polyphenoloxidase weiter kondensieren und so polymere Strukturen gebildet werden. Ein weiterer Einfluss auf die Verschiebung des Polyphenolprofils zeigte sich während der Röstung. Hierbei werden infolge der Hitzeeinwirkung sowohl monomere als auch polymere PA abgebaut. Der Gehalt an wertgebenden Inhaltsstoffen sinkt und die antioxidative Aktivität verringert sich hierbei.