Neue regulatorische T-Zell Subtypen und ihre Funktion in der experimentellen Glomerulonephritis

Abstract

Die vier zu dieser Dissertationsschrift zusammengefassten Arbeiten beschäftigen sich mit dem Vorkommen und der Funktion neuer Subklassen regulatorischer T-Zellen bei immunvermittelten Nierenentzündungen. In der ersten Arbeit wurde die Rolle von Th1-spezifischen regulatorischen T-Zellen (Treg1) untersucht. In einem spezifischen KO-Mausmodell konnte gezeigt werden, dass die Funktion dieser Zellen von dem Transkriptionsfaktor T-bet abhängig ist. Fehlen von Treg1-Zellen führte zu einer ausgeprägten Überhöhung der Th1-Antworten mit verschlechterter Nierenfunktion und verstärktem Nierenschaden im Rahmen einer akut-nekrotisierenden GN. In kompetitiven Transferexperimenten konnten die WT-Tregs ihre T-bet-defizienten Gegenspieler deutlich auskonkurrieren, was die Expansion und die Expressionslevel des Foxp3-Proteins betrifft. Das spricht dafür, dass T-bet für die generelle Fitness von Tregs wichitg ist. Außerdem konnte gezeigt werden, dass T-bet für die Expression des Traffickingrezeptors CXCR3 auf Tregs zuständig ist und T-bet auf diesem Wege die Lokalisation von Tregs in der entzündeten Niere vermittelt. CXCR3 ist auch auf Th1-Zellen ein charakteristischer Chemokinrezeptor, so dass die Spezialisierung von Treg1-Zellen vermutlich durch die CXCR3-vermittelte Kolokalisation der Treg-Zelle mit ihrem Th1-Gegenspieler definiert wird. Die zweite Arbeit untersucht die Rolle von Th17-spezifischen regulatorischen T-Zellen (Treg17). Im Modell der akuten GN konnte bereits in einer vorhergehenden Arbeit in einem spezifischen KO-Mausmodell gezeigt werden, dass die Funktion dieser Zellen von dem Transkriptionsfaktor Stat3 abhängig ist. Auch Stat3 ist für die Generierung pathogener Th17-Zellen essentiell. Das Fehlen von Treg17 Zellen führte zu einer Überhöhung der Th17-Antwort mit verschlechterter Nierenfunktion und verstärktem Nierenschaden im Modell der akut-nekrotisierenden GN. Stat3 scheint ebenfalls exklusiv für die Expression eines Traffickingrezeptors auf Tregs zuständig zu sein und zwar für den CCR6. Genau wie der CXCR3 auf Th1-Zellen, ist auch der CCR6 auf Th17-Zellen ein charakteristischer Chemokinrezeptor, so dass die Spezialisierung von Treg17-Zellen vermutlich durch die CCR6-vermittelte Kolokalisation der Treg-Zelle mit ihrem Th17 Gegenspieler definiert wird. In der hier vorgestellten Arbeit sollte die Bedeutung von Treg17 Zellen beim systemischen Lupus erythematodes (SLE) als endogen autoimmun entstehender chronischer Systemerkrankung klären. Auch während der durch Pristan-Öl induzierbaren systemischen Lupuserkrankung zeigte sich in den Treg17-defizienten Mäusen ein im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich aggravierter Verlauf mit verstärkten Th17-Antworten, stärker ausgeprägter pulmonaler Kleingefäß-Vaskulitis mit erhöhter Mortalität sowie verschlechterter Lupus-Nephritis im Langzeitverlauf über neun Monate. Die dritte Arbeit sollte die Rolle des zweiten Th17-definierenden Transkriptionsfaktors, RORγt, in regulatorischen T-Zellen charakterisieren. Überraschend konnten wir diese RORγt+Foxp3+ Zellen (biTregs) als gut abgrenzbare Population und in relevanter Frequenz bereits in unbehandelten WT-Mäusen nachweisen. Die Dynamik von biTregs wurde in Kinetikstudien im Rahmen einer experimentellen akuten GN untersucht. Sie zeigten dabei einen ganz anderen Zeitverlauf als konventionelle RORγt-negative Tregs mit massiver früher Expansion. Bemerkenswerterweise zeigten unsere Analysen, dass biTregs sowohl antiinflammatorische (IL-10, IL-35) als auch proinflammatorische (IL-17) Zytokine produzieren. Außerdem zeigten Expressoinsanalysen eine von Th17-Zellen und cTregs unterschiedliche Oberflächenmolekül- und Transkriptionsfaktorsignatur. Durch Transferstudien konnten wir belegen, dass biTregs weder aus konventionellen Tregs, noch aus Th17-Zellen entstehen. biTregs stellen also keinen Transdifferenzierungszustand dar, sondern repräsentieren eine eigenständige und unabhängige Zellpopulation. Der therapeutische Transfer von biTregs war in der Lage den Verlauf der Nephritis deutlich abzumildern, in einem ähnlichen Maße wie cTregs. Die genetische Ablation von RORγt in endogenen Tregs im gleichen Modell zeigte jedoch protektive Effekte. Diese scheinen durch die RORγt-abhängige IL-17- Sekretion der biTregs bedingt zu sein. Nach den Untersuchungen im akuten Modell, wollten wir biTregs im Modell des Pristan-induzierten SLE untersuchen. Auch unsere Analysen im Pristanmodell zeigten eine charakteristische zeitliche und organspezifische biTreg Expansion, welche mit der Entwicklung der Autoimmunität und des Gewebeschadens zusammen fällt. Außerdem fanden wir auch hier, dass eine biTreg-selektive Deletion von RORγt in Verlust der IL-17-Sekretion und einer erhöhten Treg-Aktivierung resultiert. Zusätzlich fanden wir ebenfalls eine gesteigerte Th2-Immunität. Diese Veränderungen waren mit einem Schutz vor der pulmonalen Vaskulitis und der Lupus-Nephritis verbunden.

The four publications that are combined to this cumulative dissertation deal with the appearance and function of new subclasses of regulatory T cells in immune mediated glomerular diseases. In the first study the role of Th1-specific regulatory T cells (Treg1) was assessed. In a specific knockout mouse model we could show that the function of these cells depends on the transcription factor T-bet. The lack of Treg1 cells led to a distinctive increase of Th1 responses with impaired renal function and massively increased renal damage in the nephrotoxic nephritis (NTN) model of crescentic GN (cGN). In competitive cotransfer experiments, wild-type Treg cells outcompeted T-bet-deficient Treg cells in terms of population expansion and expression levels of Foxp3, indicating that T-bet expression is crucial for general Treg fitness. Additionally, T-bet-deficient Treg cells lacked expression of the Th1-characteristic trafficking receptor CXCR3, which correlated with significant impairment of renal Treg infiltration. The second study addressed the role of Th17-specific regulatory T cells (Treg17). In a previous study using a model of acute GN our group could already show with a specific knockout mouse model, that the function of these cells depends on the transcription factor Stat3. This follows the same principle as described for the Treg1 cells. Stat3 is also essential for the generation of pathogenic Th17 cells. Lack of Treg17 cells also led to a distinctive increase of Th17 responses with impaired renal function and massively increased renal damage in the NTN model of cGN. As shown for the CXCR3 on Treg1 cells, Stat3 also seems to exclusively be responsible for the expression of a trafficking receptor. In case of the Treg17 cells this seems to be CCR6. Like the CXCR3 on Th1 cells CCR6 is also a typical chemokine receptor on Th17 cells. So the specialization of Treg17 cells seems to be basically defined threw CCR6-mediated colocalization with their Th17 counterpart. The study presented here investigated the meaning of Treg17 cells in systemic lupus erythematodes (SLE) as an autoimmune developing chronic systemic disease. Also during this pristane inducible systemic disease Treg17-deficient mice, compared to control group, showed a significantly aggravated course with enhanced Th17 responses, stronger developed pulmonary vasculitis and higher mortality. Also long-term lupus nephritis after 9 month was significantly worsened. Subsequently, the third study was supposed to characterize the role of the second Th17 defining transcription factor RORγt in regulatory T cells. Surprisingly, we were able to detect these RORγt+Foxp3+ cells (biTregs) as a well definable population in a relevant frequency already in naϊv wildtype mice. The dynamics of biTregs were assessed by kinetic studies in the NTN model of acute cGN. They showed a time response completely different from that of conventional RORγt negative Tregs with a massive early expansion. Notably, analyses of the biTreg expression profile revealed production of both anti-inflammatory (IL-10, IL-35) and proinflammatory (IL-17) cytokines. Additionally, biTregs expressed a signature of surface molecules and transcription factors distinct from those of Th17 cells and conventional Tregs. We then isolatetd biTregs from RORγt Foxp3 double reporter mice and further characterized them. Via transfer studies we could show that biTregs do not derive from conventional Tregs, nor from Th17 cells. So biTregs are not a transdifferentiation state, but represent a discrete and independent cell population. Therapeutic transfer of biTregs suppressed the development of nephritis to an extent similar to that observed with transferred cTregs. Intriguingely, endogenous biTregs displayed additional proinflammatory functions in NTN that were abrogated by cell-specific deletion of RORγt. This seems to be due to their IL-17 secretion. After our studies in the acute model of NTN, we also wanted to investigate biTergs in the chronic model of pristane-induced SLE. This model significantly resembles human SLE and we thereby wanted to acknowledge their clinical relevance. Our analyses in the pristane-model also revealed expansion of IL-17 producing biTregs in a distinctive time-course and organ-specific pattern, coincident with the development of autoimmunity and tissue injury. As already shown in the NTN-model, we again found that IL-17 secretion by biTregs was abrogated completely in Foxp3CrexRorcfl/fl mice. Furthermore, Tregs showed a more activated phenotype after cell-specific inactivation of RORγt signaling. Finally, and remarkably, we found elevated Th2 immunity in the knockout mice, meaning biTregs seem to suppress antiinflammatory Th2 immunity in a RORγt-dependent manner. These modifications in Foxp3CrexRorcfl/fl mice were associated with significant amelioration of pristane-induced pulmonary vasculitis and lupus nephritis.