Biphasic influence of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis on epidermal Tight Juntions in submerged and 3D tissue culture

Abstract

The skin is a pivotal barrier against the invasion of pathogens and allergens and the skin barrier is part of the innate immune system. Tight junctions (TJs) contribute to the overall skin barrier by forming a physical barrier and interacting with the other components of the skin barrier. Previously, in vivo analyses of infected skin and a porcine ex vivo infection model with Staphylococcus aureus (S. aureus) revealed changes in immunolocalisation of TJ proteins. As a change of proteins does not necessarily reflect alterations in the functionality of TJs, the aim of this study was to investigate the influence of S. epidermidis and S. aureus on TJ functionality and to elucidate the underlying mechanisms on TJ functionality in normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) in a submerged model and in reconstructed human epidermis (RHE). By using NHEKs under submerged conditions, a dose dependent increase of transepithelial electrical resistance (TER) and decrease of paracellular permeability for a 4 kDa tracer during short-term incubation with S. epidermidis and S. aureus was observed. This argues for a prevention mechanism by strengthening of the innate immune system via tightening the TJ barrier to reduce/delay pathogen uptake. The usage of bacterial mutants revealed that the accessory gene regulator (agr) plays a role in this effect. However, even though the outcome is similar, mechanisms are different between S. epidermis and S. aureus. Short-term inoculation with both bacteria resulted in relocalisation of claudin-4 to the cellular membranes, while for S. aureus additionally increased levels of phosphorylated occludin were evident, which also resulted in an increase of this protein at the cell-cell borders. Experimental data hint for a role of Toll-like receptors (TLR) and cytokines for these differences. Investigation of RHE confirmed the phosphorylation and relocalisation of Ocln to the cell membranes after S. aureus inoculation. However, the TJ barrier-tightening effect could not be measured in this system, putatively due to camouflaging effects by the Stratum corneum. At later time points of incubation with both bacteria in both model systems, a decreased TJ barrier was found. This was not accompanied by increased cell death, but by internalisation of TJ proteins. Bacterial virulence factors of the agr-regulon are not responsible for this internalisation, but inflammation seems to be involved. A pretreatment of the submerged culture with an Atopic Dermatitis mimicking mix consisting of cytokines and TLR agonists followed by infection also resulted in a short-term increase in TER for both bacteria, but for S. aureus a subsequent accelerated decrease was observed, hinting for a supporting effect of AD conditions on S. aureus infection. In conclusion, this work demonstrates that infection of primary keratinocytes not only with the commensal S. epidermidis, but also with the pathogen S. aureus results in a transient upregulation of TJ functionality, hinting for a prevention mechanism of keratinocytes against invasion of pathogens. However, long-term infection results in a TJ barrier breakdown. In AD related conditions, the TJ barrier breakdown is intensified after S. aureus but not S. epidermidis infection.

Die Haut bildet eine zentrale Barriere gegen das Eindringen von pathogenen Organismen und Allergenen und ist daher ein Teil der angeborenen Immunabwehr. Tight Junctions (TJs) spielen für die Gesamthautbarriere eine wichtige Rolle, denn sie bilden eine physikalische Grenze und interagieren mit den anderen Komponenten der Hautbarriere. In vivo Analysen infizierter Haut, sowie ein porcines ex vivo Infektionsmodell mit Staphylococcus aureus (S. aureus) haben Verändereungen in der Immunolokalisation von TJ proteinen gezeigt. Da Veränderungen von Proteinen nicht zwangsläufig eine veränderte Funktionalität der TJs widerspiegeln, war es das Ziel dieser Arbeit den Einfluss von S. epidermidis und S. aureus auf die TJ Funktionalität von primären humanen Keratinozyten (NHEKs) in einem überfluteten Modell sowie einer epidermalen Hautrekonstruktion (RHE) zu untersuchen und die zu Grunde liegenden Mechanismen zu analysieren. NHEKs im überfluteten Modell zeigten nach kurzzeitiger Inkubation mit S. epidermidis und S. aureus. einen dosisabhängigen Anstieg des transepithelialen Widerstandes (TER) sowie einen Abfall der parazellulären Permeabilität für ein 4 kDa großes Tracermolekül. Diese Beobachtung spricht für einen Schutzmechanismus, in dem die angeborene Immunabwehr durch eine Verdichtung der TJ Barriere gestärkt wird um das Eindringen Pathogener zu verhindern/verzögern. Die Verwendung bakterieller Mutanten zeigte, dass der „accessory gene regulator“ (agr) bei diesem Effekt eine Rolle spielt. Jedoch obwohl das Ergebnis ähnlich ist, gibt es verschiedene Mechanismen zwischen S. epidermidis und S. aureus. Kurzzeitige Inokulation mit beiden Bakterien zeigte eine Relokalisation von Claudin-4 zu den Zellmembranen, wohingegen für S. aureus zusätzlich höhere Level von phosphoryliertem Occludin ersichtlich waren, was auch zu einer verstärkten Lokalisation dieses Proteins an die Zellgrenzen führte. Experimentelle Ergebnisse deuten auf eine Rolle von Toll-like-Rezeptoren (TLR) und Zytokinen für diese Unterschiede hin. Untersuchungen an RHE bestätigten die Phosphorylierung und Relokalisierung von Occludin zu den Zellgrenzen nach S. aureus Inokulation. Trotzdem konnte der TJ-Barriere stärkende Effekt in RHE nicht gezeigt werden, was vermutlich an einem Tarneffekt des Statum corneum liegt. Zu späteren Zeitpunkten der Inkubation mit beiden Bakterien wurde in beiden Modellsystemen eine Schwächung der TJ Barriere festgestellt, was nicht durch Zelltod hervorgerufen wurde, sondern durch eine Internalisierung von TJ Proteinen. Hierbei spielen bakterielle Virulenzfaktoren des agr-Regulons keine Rolle, aber eine Inflammationsreaktion scheint ein Trigger zu sein. Die Vorbehandlung der überfluteten Kultur mit einem atopische Dermatitis nachahmenden Mix aus Zytokinen und TLR-Agonisten gefolgt von einer Infektion zeigte nach kurzzeitiger Inokulation auch einen Anstieg des TERs, allerdings führte S. aureus zu einem schnelleren und stärkeren Abfall des TERs, was auf eine Begünstigung atopischer Umstände für eine S. aureus Infektion hindeutet. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass eine Infektion von primären Keratinozyten nicht nur mit dem Kommensalen S. epidermidis, sondern auch mit dem Pathogenen S. aureus, in einer transienten hochregulation der TJ Funktionalität endet. Dies spricht für einen Schutzmechanismus gegen das Eindringen von Pathogenen. Dennoch führt eine längerfristige Infektion zu einem Verlust der TJ Barriere. Unter atopischen Umständen ist dieser Barriereverlust durch S. aureus, aber nicht durch S. epidermidis, verstärkt.