Funktionelle Analyse des Kynureninase-Proteins im humanen Pankreaskarzinom

Abstract

Das Pankreaskarzinom gehört zu den aggressivsten bekannten Tumorentitäten, woraus über Jahrzehnte klinischen Fortschritts hinweg weiterhin beinahe ebenso hohe Mortalitäts- wie Inzidenzraten dieser Erkrankung resultieren. Das Fehlen von Frühsymptomen, das schnelle infiltrative und metastasogene Wachstum dieses Tumors, sowie das schlechte Ansprechen auf herkömmliche Chemotherapieregime, stellen höchste Ansprüche an die interdisziplinäre Behandlung betroffener Patienten. In unseren Studien wurde erstmalig die robuste Überexpression des am Tryptophanabbau maßgeblich beteiligten Enzyms Kynureninase in einem Großteil untersuchter Pankreaskarzinome enthüllt. Diese Studien wurden zur gegenseitigen Verifikation an Zellmaterial aus Kultur, sowie an Resektaten am Pankreas operierter Patienten durchgeführt. Hieraus erfolgt die Erkenntnis über die augmentierte Kynureninase-Expression vieler Karzinome gegenüber benignem Pankreasepithel, wie auch den Expressionszuwachs im Rahmen des Erwerbs der Chemotherapieresistenz gegenüber Gemcitabin bei Pankreaskarzinomzellen in vitro. Zur weiteren Charakterisierung wurde mit Hilfe von Immunzytologie und subzellulärer Proteinanalyse die Präsenz des Enzyms im Zytoplasma, wie auch im Zellkern, insbesondere imponierend im Falle der chemotherapieresistenten Pankreaskarzinomzellen, dargelegt. Auch ein extrazelluläres Vorkommen der Kynureninase wurde in ansteigendem Maße für Karzinomzellen und chemotherapieresistente Karzinomzellen, deckungsgleich zu den zuvor intrazellulär beobachteten Proteinverhältnissen, demonstriert. Weiterhin wurde die Abhängigkeit der Expression der Kynureninase im Pankreas vom Zytokin Interferon-γ, wie bereits für weite Teile des Stoffwechselweges beschrieben gewesen, bewiesen. Funktionelle Aufschlüsse über die Rolle der Kynureninase im Pankreaskarzinom ergab die Herabregulation dieser mittels shRNA. Die Blockade der Kynureninase-Expression führte in untersuchten Zellen zu einer signifikanten Proliferationshemmung unter fortwährender Behandlung mit Gemcitabin. Die Identifikation neuer Kynureninase-interagierender Proteine im Pankreaskarzinom gibt Ausblick auf experimentell zu belegende molekulare Wirkungsweisen der Kynureninase, abgesehen von der Mitwirkung bei der Bereitstellung des Energielieferanten NAD+. Die erhobenen Beobachtungen lassen die in diesem Kontext bislang vernachlässigte Kynureninase, als potentiellen Tumormarker und möglichen Mediator von Resistenzmechanismen gegenüber einer chemotherapeutischen Behandlung, und damit in diagnostischer und therapeutischer Hinsicht, zu einem neuen Anhaltspunkt für weitere Forschung avancieren.

Pancreatic cancer is among the most lethal diseases worldwide, still exhibiting almost equal mortality as incidence rates in spite of clinical advances over the last decades. The absence of early symptoms, rapid infiltrative and metastatic growth as well as the weak response of this tumour entity to common chemotherapeutic regimes demand high standards of interdisciplinary therapy. Our study revealed for the first time the robust overexpression of kynureninase, an enzyme involved in the tryptophan degradation pathway, in pancreatic carcinomas. For mutual verification, this study was conducted with cells in culture and with specimen of patients who had undergone pancreatectomy at the university hospital Hamburg-Eppendorf. Our here shown results provide further insights into the augmented kynureninase-expression levels of cancer cells in comparison to benign epithelia of the pancreas, and the increment of expression of pancreatic cancer cells during acquisition of chemoresistance towards gemcitabine in vitro. For further characterisation, the presence of kynureninase in the cytoplasm and nucleus, impressively in case of chemoresistant cells, was shown by immunocytochemistry and subcellular protein fractionation. Even the extracellular secretion of kynureninase, with increased amounts for cancer cells and chemoresistant cancer cells was demonstrated, showing coherence with prior results. Additionally, the dependency between kynureninase-expression and stimulation with IFN-γ, as generally assumed for proteins involved in tryptophan degradation, was substantiated. For functional analysis of the role of kynureninase in pancreatic cancer, a shRNA mediated knockdown strategy was performed. The blockade of kynureninase expression in pancreatic cancer cells resulted in significantly decreased proliferation rates following chemotherapeutic treatment with gemcitabine in the analyzed cells. The identification of new kynureninase-interacting proteins in pancreatic cancer gives an outlook on prospective experiments for further characterisation of molecular mechanisms of kynureninase beyond its known impact by providing cells with the energy supplier NAD+. Taken together, these results define kynureninase as a potential tumour marker and mediator of chemoresistance and suggest novel strategies for further research on pancreatic cancer with respect to both diagnosis and therapy of this lethal disease.