Molekulare und funktionale Charakterisierung der ADP-Ribosylierung der IL-2 Rezeptoruntereinheit CD25 und des homophilen Interaktionsmoleküls CD229

Abstract

Die ART2.2 ist ein membranständiges Enzym, welches Membranproteine unter Verwendung des Substrates NAD in einer posttranslationalen Reaktion kovalent unter Freisetzung von Nicotinamid ADP-ribosyliert. Zwei Membranproteine, die ADP-ribosyliert werden, sind die Alpha-Untereinheit des trimeren IL-2-Rezeptors CD25 und das homophile Interaktionsmolekül CD229. CD25 ist für die klonale Expansion von Lymphozyten von herausragender Bedeutung. Das Mitglied der Immunglobulin Superfamilie CD229 kommt vor allem auf B- und T-Lymphozyten vor und erfüllt bei der Ausbildung der Immunologischen Synapse bei der Interaktion von Antigen-präsentierender Zelle und T-Zelle eine noch unbekannte Rolle. Im ersten Teil der Dissertation wurden verschiedene Lymphomzelllinien, konventionelle und regulatorische T-Zellen auf Zielproteine der ART2 untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass CD229 auf fast allen untersuchten Lymphomzelllinien, Yac-1, DC27.10 und EL4-Zellen vorkommt. CD25 hingegen kommt auf Yac-1-Zellen vor. Die ADP-Ribosylierung von CD25 und CD229 wurde auf Yac-1-Zellen sowohl mittels eNAD und Chemolumineszenz als auch mittels 32P-NAD und Autoradiographie nachgewiesen. CD25 und CD229 stellen zudem Ziele der ADP-Ribosylierung auf primären T-Zellen bzw. regulatorischen T-Zellen dar. Dabei zeigt sich, dass CD229 ein Hauptziel der ADP-Ribosylierung ist. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde mittels zielgerichteter Mutagenese untersucht, an welchen Argininen msCD229 ADP-ribosyliert wird. Wenigstens eines der Arginine vom Argininpaar RR254 wird ADP-ribosyliert. Im dritten Teil der Dissertation wurden die extrazellulären Domänen von CD229 als Fusionsproteine mit dem Fc-Teil von IgG1 kloniert und in HEK-293-Zellen exprimiert. Die Fusionsproteine können für weitere funktionelle Versuche bezüglich des Einflusses der ADP-Ribosylierung auf die homophile Interaktion von CD229 genutzt werden. Zudem wurde nachgewiesen, dass die ADP-Ribosylierung von CD25 einen hemmenden Einfluss auf dessen Signalkaskade hat.

The membrane anchored ART2 is an extracellular enzyme, which uses NAD as a substrate to covalently ADP-ribosylate membrane proteins on arginine residues in a posttranslational reaction, producing nicotinamide as a byproduct of the reaction. Two known targets of this reaction are CD25, the alpha subunit of the trimeric IL-2 receptor complex and the homophilic interaction molecule CD229. CD25 is of importance for the clonal expansion of activated lymphocytes. As a member of the immunoglobulin superfamily CD229 is expressed mainly on B- and T-lymphocytes and is thought to participate in forming the immunological synapse, the contact area between B-cell and T-cell. CD229 is recruited to the area of contact and interacts homophilically. In the first part of the dissertation, different lymphoma cell lines were examined for their expression of known ART2-target proteins. CD229 was found on all examined cell lines, i.e. on Yac-1, DC27.10 and EL4 cells. CD25 on the other hand was expressed by Yac-cells. ADP-ribosylation of CD229 and CD25 was confirmed by using 32P-NAD or eNAD in Yac-1 cells. In common T-cells and Tregs CD229 is evidently a primary target of ADP-ribosylation. The second part of this dissertation explores the arginine residues of msCD229 as potential targets of ADP-ribosylation by means of site-directed mutagenesis. Radioactive assays revealed that at least one of the arginines of the doublett RR254 is ADP-ribosylated. The third and last part of this dissertation deals with the functional consequences of ADP-ribosylation of CD25 und CD229. ADP-ribosylation of CD25 reduces pSTAT5 levels, thereby having an inhibitory effect on CD25 signal transduction. CD229-Fc fusionproteins were cloned and produced in HEK-293 cells. The fusion proteins can be used for future assays to further asses the effect of the ADP-ribosylation of CD229 on its homophilic interaction.