Glutarazidurie Typ 1 : Untersuchungen zu Auswirkungen von „missense“-Mutationen auf Enzymexpression, Enzymsortierung, Enzymstabilität und den Abbau der Glutaryl-Coenzym A Dehydrogenase in der Zellkultur

Abstract

Bei der Glutarazidurie Typ 1 (GA1) akkumulieren, bedingt durch einen Defekt des mitochondrialen Matrixenzyms Glutaryl-Coenzym A -Dehydrogenase (GCDH), die toxischen Metabolite Glutarsäure (GA) und 3-Hydroxyglutarsäure (3OHGA) in Körperflüssigkeiten und Geweben. Bei GA1-Patienten kommt es während kataboler Stoffwechselsituationen zur krisenhaften neurotoxischen Degeneration des Striatums. Bis dato konnte keine Korrelation zwischen dem klinischen Phänotyp und dem vorliegenden Genotyp hergestellt werden. So zeigen Patientenmutationen mit Restaktivitäten von bis zu 30% durchaus schwerwiegende klinische Verläufe, wie z.B. die an der Oberfläche der GCDH lokalisierte homozygote Mutation p.Met263Val. Der Pathomechanismus ist bislang ungeklärt, vermutet wurden bislang Effekte oberflächlich lokalisierter Aminosäurenaustausche auf das Oligomerisierungs- und Interaktionsverhalten der GCDH. Im ersten Teil der Arbeit wurden 18 ausgewählte pathogene Mutationen, die sich alle an der Oberfläche des GCDH-Proteins befinden, hinsichtlich ihrer Expression, intrazellulärer Lokalisation und ihrer Stabilität in der Zellkultur untersucht: a) Ein Großteil der GCDH-Mutanten zeigte, verglichen mit dem Wildtyp-Protein, eine verringerte Expression; b) Alle mutierten GCDH-Proteine wiesen eine Kolokalisation mit dem Mitochondrium auf; c) 15 der 18 untersuchten Mutanten zeigten einen beschleunigten intramitochondrialen Abbau als Ursache der unter a) beschriebenen reduzierten Proteinmenge. In den Kolokalisationsstudien konnte bei der Mutante p.Arg88Cys in der Immunfluoreszenzanalyse zusätzlich eine tubuläre Variation der Struktur beobachtet werden. Diese scheint nach weitergehenden Analysen direkt mit Veränderungen an der Aminosäurenposition p.Arg88 verknüpft zu sein. Ein unmittelbarer Zusammenhang zu spezifischen Aminosäureresten konnte aber nicht gezeigt werden. Gegenstand des zweiten Teils der Arbeit war die Identifikation der am gesteigerten Abbau mutierter GCDH beteiligten Protease(n). Die hierfür als Kandidaten in Frage kommenden mitochondrialen Matrixproteasen LONP1 und CLPP wurden mittels siRNA-„knockdown“ in Patienten- und Kontrollfibroblasten und nachfolgender metabolischer Markierung der GCDH in „Pulse-Chase“-Versuchen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die GCDH-Proteinmenge bei Herabregulation von LONP1 wesentlich anstieg. Diese Beobachtung liefert erstmalig Indizien für die am Abbauprozess beteiligte Protease und somit einen potenziell wertvollen Angriffspunkt für zukünftige therapeutische Strategien, um den vorzeitigem Abbau von GCDH-Mutanten mit bestehenden Restaktivitäten zu modifizieren.

The autosomal recessively inherited neurometabolic disorder glutaric aciduria type 1 (GA1) is caused by mutations in the gene encoding the mitochondrial matrix enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (GCHD). GCDH catalyses the oxidative decarboxylation of glutaryl-CoA in the degradation pathway of the amino acids lysine, hydroxylysine, and tryptophane. Deficiency of GCDH leads to the accumulation of the pathogenic dicarboxylates glutaric acid and 3-hydroxyglutaric acid in tissues and body fluids. GA1 patients are at risk of developing encephalopathic crises promoted by catabolic conditions such as infections, fever, diarrhoea or vomiting. A correlation between the genotype and the clinical phenotype in glutaryl-CoA dehydrogenase deficiency has not yet been identified. GCDH-mutations have been described with very high residual enzyme activity of up to 30%, leading to severe clinical features in patients, for instance irreversible destruction of striatal neurons with subsequent development of a dystonic / dyskinetic movement disorder. The GCDH-protein consists of four GCDH-monomers which build the active GCDH-homotetramer. Most patients displaying residual GCDH- activities ranging between 5 and 30% of healthy controls are hetero- or homozygous carriers of mutations which affect amino acid residues on the surface of the GCDH-protein. The underlying pathogenic mechanisms are still unknown. In the first part of the thesis, 18 disease-causing GCDH-mutations affecting amino acid residues localised on the surface of the GCDH-protein were selected and analysed with respect to their effect on protein expression, intracellular sorting and protein stability. More than half of the GCDH-myc surface mutants overexpressed in HeLa cells showed a significantly reduced steady state level in western blot analysis in comparison to the wild-type enzyme. To examine whether the disease-related mutations affect the correct sorting or localisation of GCDH into mitochondria, double-immunofluorescence stainings were performed in HeLa cells. Both wild-type and all mutant GCDH-myc completely co-localised with manganese-dependent superoxide dismutase (MnSOD - a mitochondrial marker protein). This indicates a correct targeting and import into mitochondria. The substitution of arginine 88 to cysteine led to a significantly changed mitochondrial morphology showing a tubular staining pattern. Other amino acid residues surrounding position 88 showed no comparable staining pattern, whereas alteration of residues on position 88 resulted in a similar staining pattern. This indicates that the position of the mutation residue is responsible for the development of the tubular staining. Pulse chase experiments with [35S]-methionine labled GCDH-wild type and -mutant proteins with subsequent immunoprecipitation were performed to test whether the selected GCDH-mutants lead to a decreased stability and accelerated degradation of the mutant protein. The (large) majority of mutant proteins showed an increased degradation rate compared to the wild type protein. This data provides a first insight into the biochemical and molecular characteristics of pathogenic GCDH-surface mutations. The second part of the thesis focused on the further analysis of the increased degradation, in particular the identification of the protease responsible for this process. Potential candidates are the mitochondrial matrix proteases LONP1 and CLLP, which play a decisive role in the protein quality control system of the mitochondria. The proteases were downregulated in patient and control fibroblasts via specific siRNA. The specific patient mutant p.Arg402Trp, the most common mutation among the Caucasian population, was selected for the knock down experiments since it shows a significantly reduced half life. Following the knock down experiments in control- and patient p.Arg402Trp-fibroblasts, the GCDH was metabolically labeled with [35S]-methionine and analysed in pulse-chase experiments. As described above, the GCDH-wildtype and -mutant protein were immunprecipitated and further analysed via SDS-PAGE. The results showed a significant increase of the protein amount in the LONP1-downregulated cells. This gives first evidence to the responsible protease involved in the degradation of mutant GCDH-proteins.