Analyzing Crystal Growth Phenomena and Mechanisms for the Production and Optimization of Protein Crystals for Serial Crystallography

Abstract

Protein crystallization represents nowadays one of the main limiting factors in X-ray crystallography for structure retrieval. The technical advancements of high intensity X-ray radiation sources, such as third generation synchrotrons and free-electron lasers (FELs) extended the possibilities for achieving structural information of biological targets by using serial crystallographic methods and protein crystals that are in the nano- and micrometer size range. The high potential of serial crystallography and successful results obtained so far in this field have posed a great interest and demand on sample preparation for generating sub-microscopic crystals. As for the preparation of protein crystals for conventional crystallography, the samples needed for serial femtosecond and/or millisecond crystallography (SFX and SMX) require in-depth knowledge of the mechanisms of nucleation and crystal growth in order to optimize the crystallization methods for obtaining nano- and microcrystals.

Die Kristallisation von Proteinen ist noch immer einer der limitierenden Faktoren in Röntgenkristallographie-Untersuchungen zur Strukturaufklärung von biologischen Makromoleküle. Der technische Fortschritt hochintensiver Röntgenstrahlungsquellen wie Synchrotrons der dritten Generation und Freie-Elektronen-Laser (FELs) bieten neue Möglichkeiten strukturelle Informationen biologischer Makromoleküle zu erhalten, dies mittels seriellen kristallographischen Methoden an Kristallen im Nano- und Mikrometerbereich. Das hohe Potential der seriellen Kristallographie und die bemerkenswerten Ergebnisse, die bisher auf diesem Gebiet erzielt wurden, haben ein großes Interesse und eine große Nachfrage nach der Probenvorbereitung zur Produktion von submikroskopischen Kristallen geschaffen. Im Vergleich zur Herstellung von Proteinkristallen für die klassische Kristallographie, erfordern die für die serielle Femtosekunden- und/oder Millisekunden-Kristallographie (SFX und SMX) benötigten Proben ein präzises Verständnis der Mechanismen der Nukleation und des Kristallwachstums, um die Kristallisationsmethoden für Mikro- und Nanokristallen zu optimieren. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein kürzlich entwickeltes Verfahren zur automatisierten Kristallisation (XtalController900), gekoppelt mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) zur Produktion und Bewertung von Proteinmikrokristallen vor der Datensammlung. Die Analyse der Kristallisationsbedingungen von drei löslichen Proteinen (Thaumatin aus thaumatococcus daniellii, Plasmodium falciparum Glutathione S-Transferase (PfGST) un SP – zielprobe) mit DLS zeigte eine klare Unterscheidung zwischen erfolgreicher Kristallisation und Probenfällung durch Auswertung des Anordnungssmechanismus von Proteinmolekülen mittels hydrodynamischer Radiusverteilung (Rh). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Bewertung der Änderungen der Teilchenradien eines Kristallisationstropfens dazu beitragen kann, die notwendigen Bedingungen eines Kristallisationsansatzes zu untersuchen und dahingehend zu modifizieren Proteinkristalle zu erhalten und Proteinfällung zu vermeiden. Eine detaillierte Untersuchung der Nukleations- und Kristallwachstumsphasen der drei Proteine wurde mittels DLS durchgeführt und zeigte verschiedene Mechanismen von Phasenübergängen während der Bildung von Kristallen, die durch Elektronenmikroskopie analysiert warden konnten. Die mikroskopischen Aufnahmen legen nahe, dass die der Nukleation zugeschriebene Rh-Verteilung einen zweistufigen Nukleationsmechanismus zeigen könnte, bei dem ein Übergang von Clustern mit hoher Proteinkonzentration (ca. 200-300 nm) in stabile Kristallkeime (ca. 400-600 nm) stattfindet. Darüber hinaus wurde Probenmaterial aus der Kristallwachstumsphase, die sich durch eine Rh-Verteilung zwischen ca. 800 und 3000 nm auszeichnet, erfolgreich als Proteinkristalle identifiziert. Komplementäre In-situ-DLS-Messungen die während der automatisierten Proteinkristallisation gesammelt wurden, wurden verwendet, um experimentelle Phasendiagramme aufzuzeichnen, die die Hauptunterschiede im endgültigen Kristallisationsergebnis erklären konnten. Die mit dem XtalController900 hergestellten PfGST-Kristalle und Thaumatin-Mikrokristalle wurden durch klassische Röntgenkristallographie und Pulverdiffraktometrie quantifiziert. Die Informationen, die durch die experimentellen Phasendiagramme geliefert wurden, lieferten die Grundlage für die Produktion größerer Mengen von Proteinmikrokristallen für weitere serielle Kristallographieanwendungen. Die serielle Millisekunden-Kristallographie zur experimentellen Phasenbestimmung von Thaumatin wurde erfolgreich an Thaumatin-Mikrokristallen mit Synchrotronstrahlung durchgeführt. Die seriell gesammelten Daten wurden für die native Schwefel-Phasierung verwendet, und mit Angabe der Substruktur konnte eine Elektronendichte generiert werden, die erfolgreich zur automatischen Strukturlösung des Proteins führte.