Identification of potential disease-driving proteins in mouse models of ALS caused by mutant TDP-43

Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a devastating neurological disease that leads to progressive loss of motor neuron (MN) function. It is almost always fatal and there is currently no curative treatment. The RNA-binding protein TDP-43 is frequently mislocalized in ALS patient MNs and is the major component of ubiquitinated aggregates that characterize ALS pathology. Moreover, a subset of ALS patients have mutations in TARDBP, the gene, encoding TDP-43. Numerous studies analyzing patient samples, as well as animal and cell-based disease models, strongly support altered RNA regulation by TDP-43 within MNs as a major cause of disease. Nevertheless, the specific molecular changes that actually trigger disease onset remain unclear. Here, I investigate molecular changes in MNs during the transition from the pre-symptomatic phase to disease onset in TDP-43–driven ALS. For this purpose, I applied Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to established mouse models of ALS caused by mutant TDP-43. After a time-course with behavioral characterization, I collected spinal cords from mutant TDP-43 mice and matched controls at time points corresponding to pre-symptomatic and early symptomatic phases. Ribosome-associated mRNA from MNs was isolated via TRAP, followed by genome-wide high-throughput sequencing (RNA-Seq). Bioinformatic analysis of these samples revealed a number of mRNAs that are up- or downregulated in MNs of ALS models specifically at disease-onset. I confirmed altered regulation of TEX26 and PLEKHB1 via qRT-PCR in an independent TRAP experiment. Moreover, using quantitative immunostaining, I also detected corresponding changes at the protein level for PLEKHB1 and SYNGR4 in spinal MNs of two different hTDP-43 mutant mouse ALS models at disease onset. Thus, I have identified proteins that have the potential to be disease drivers, since they show altered regulation in MNs of ALS mouse models at the time when disease develops. TRAP enables access to ribosome-associated mRNAs from specific cells in a complex mixture. However, TRAP presumably cannot monitor ribosome density, since an mRNA should be immunoprecipitated regardless of the number of ribosomes bound. To overcome these limitations, I started to develop a new method, Gradient-TRAP. This method combines sucrose density gradient separation of mRNAs according to the number of bound ribosomes, with immunoprecipitation of tagged ribosomes and associated mRNAs from specific gradient fractions. I first performed in vitro proof-of-concept experiments with a motor neuronal cell line transfected with GFP-L10a for TRAP. An established paradigm for translational control was used: induction of oxidative stress with sodium arsenite. This led to a strong inhibition of translation and polysome collapse, as expected. Using qRT-PCR to monitor mRNA levels across the gradients, it was found that most mRNAs showed dramatically reduced ribosome density after treatment. Remarkably, TRAP directly from lysates did not reveal any changes in ribosome co-immunoprecipitation. Thus, dramatic changes in ribosome density escape detection by conventional TRAP assays, as predicted. I also obtained evidence that Gradient-TRAP can work with in vivo material from adult mouse spinal cord.

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine verheerende neurologische Erkrankung, die zu einem fortschreitenden Verlust der Funktion von Motoneuronen (MN) führt. Die Krankheit endet fast immer tödlich und es gibt derzeit keine Heilungschancen. Das RNA-bindende Protein TDP-43 ist häufig in MN von ALS-Patienten fehllokalisiert und gilt als Hauptbestandteil ubiquitinierter Aggregate, welche die ALS-Pathologie kennzeichnen. Darüber hinaus hat eine Untergruppe von ALS-Patienten Mutationen in TARDBP, dem Gen, das TDP-43 kodiert. Zahlreiche Studien, die Patientenproben sowie Tier und zellbasierte Krankheitsmodelle analysieren, legen nahe, dass die veränderte RNA-Regulation durch TDP-43 in MN Hauptauslöser für die Erkrankung ist. Dennoch bleiben die spezifischen molekularen Veränderungen, die den Ausbruch der Krankheit auslösen, noch unklar. In dieser Arbeit untersuche ich molekulare Veränderungen in MN während des Übergangs von der präsymptomatischen Phase zum Ausbruch der Krankheit bei TDP-43- induziertem ALS. Zu diesem Zweck habe ich die Translating Ribosom Affinity Purification (TRAP) auf etablierte Mausmodelle von ALS angewendet, die durch mutiertes TDP-43 verursacht wurden. Nach einem Zeitverlauf, bei dem eine Verhaltenscharakterisierung erfolgte, sammelte ich Rückenmarkstränge von Mutanten TDP-43-Mäusen in präsymptomatischen und frühen symptomatischen Phasen. Die Ribosom-assozierte mRNA aus MN wurde über TRAP isoliert. Im Anschluss wurde eine genomweite Hochdurchsatz-Sequenzierung (RNA-Seq) durchgeführt. Die bioinformatische Analyse dieser Proben ergab, dass - vor allem bei Krankheitsbeginn - eine Reihe von mRNAs in den MNs von ALS-Modellen hoch- oder herunterreguliert sind. Des Weiteren konnte ich eine veränderte Regulation von TEX26 und PLEKHB1 über qRT-PCR in einem unabhängigen TRAP-Experiment bestätigen. Durch die Verwendung quantitativer Immunfärbung entdeckte ich zu Krankheitsbeginn entsprechende Veränderungen auf der Proteinebene für PLEKHB1 und SYNGR4 in MNs des Rückenmarks von zwei verschiedenen hTDP-43-mutierten Maus-ALS-Modellen. Vor diesem Hintergrund habe ich Proteine identifiziert, die als Krankheitstreiber in Frage kommen könnten, da sie - zum Zeitpunkt der Krankheitsentwicklung - eine veränderte Regulation in MNs von ALS-Mausmodellen zeigen. TRAP ermöglicht den Zugang zu Ribosom-assoziierten mRNAs aus spezifischen Zellen in einer komplexen Zusammensetzung. TRAP kann die Ribosomendichte vermutlich jedoch nicht bestimmen, da eine mRNA unabhängig von der Anzahl der gebundenen Ribosomen immunpräzipitiert würde. Um diese Einschränkungen zu überwinden, habe ich begonnen, eine neue Methode, die Gradient-TRAP, zu entwickeln. Diese Methode kombiniert Saccharose-Dichtegradiententrennung von mRNAs, getreu der Anzahl von gebundenen Ribosomen, mit Immunpräzipitation von markierten Ribosomen und assoziierten mRNAs aus spezifischen Gradientenfraktionen. Ich führte zuerst In-vitro-Proof-of-Concept-Experimente mit einer motorischen neuronalen Zelllinie durch, die mit GFP-L10a für TRAP transfiziert war. Ein in der Literatur beschriebenes Paradigma für die Translationskontrolle wurde verwendet: Induktion von oxidativem Stress mit Natriumarsenit. Dies führte wie erwartet zu einer starken Hemmung der Translation und zum Polysomenkollaps. Mit qRT-PCR zur Bestimmung der mRNA-Konzentrationen über die Gradienten wurde festgestellt, dass die meisten mRNAs nach der Behandlung eine drastisch verringerte Ribosomendichte aufwiesen. Bemerkenswerterweise zeigte TRAP direkt aus Lysaten keine Veränderungen in der Ribosomen-Co-Immunpräzipitation. Daher können dramatische Änderungen der Ribosomendichte durch herkömmliche TRAP-Assays, wie vorhergesagt, nicht aufgedeckt werden. Ausserdem konnte Ich zeigen, dass es möglich ist Gradienten-TRAP mit in vivo Material aus dem Rückenmark erwachsener Mäuse durchzuführen.