The impact of protein oxidation on kinase-mediated phosphorylation and cardiac myocyte contractile function

Abstract

Pathologies, such as cancer, inflammatory and cardiac diseases are commonly associated with long-term increased production and release of reactive oxygen species referred to as oxidative stress. Thereby, oxidation of target proteins conferring protein dysfunction contributes to disease progression. Importantly, trials to scavenge oxidants by systemic antioxidant therapy failed. This observation supports the notion that oxidants are indispensable physiological signaling molecules that induce oxidative posttranslational modifications in target proteins. The signaling function of oxidants can even be exploited therapeutically, as it was shown for HNO donors, a class of compounds that act by protein oxidation. HNO donors exert beneficial effects on cardiovascular function and are considered as potential candidates for the clinical treatment of heart failure. Although protein phosphorylation is the main mechanism that governs positive inotropic effects in cardiac myocytes, information is scarce on how acute protein oxidation by HNO leads to the observed enhancement of cardiac myocyte contractile function. To gain understanding of the underlying molecular mechanisms is crucially important as these compounds are tested for their clinical potential to treat patients with acute decompensated heart failure. This PhD thesis provides a thorough characterization of the molecular mechanisms that are responsible for the positive inotropic effects of experimental (1-nitrosocyclohexyl acetate; NCA) and clinical (CXL-1020) HNO donor compounds. Unexpectedly, experiments performed in adult rat ventricular myocytes revealed that exposure to HNO released by HNO donor compounds enhanced the net phosphorylation state of cardiac myocyte proteins that regulate excitation-contraction coupling. Using Förster resonance energy transfer technology, gel electrophoresis under non-reducing conditions and subcellular protein fractionation, HNO-mediated translocation and activation of the redox-sensitive cAMP-dependent protein kinase (PKA) was found that apparently is responsible for integration of the oxidant stimulus into substrate protein phosphorylation. Furthermore, there is experimental evidence shown that in addition to oxidative activation of PKA, HNO released by CXL-1020 strongly inhibited the oxidant-susceptible protein phosphatase 2A, thus additionally contributing to the observed enhancement in substrate protein phosphorylation. The data obtained during this PhD thesis allow the conclusion that there are significant molecular and functional differences evoked by established HNO donor compounds that strongly recommend characterization of each individual donor before its clinical application. Furthermore, in line with results obtained from human cardiac tissue, the data support the conclusion that phosphorylation remains the main posttranslational modification that reliably triggers enhancement in contractile function by direct modulation of cardiac myocyte proteins. Accordingly, the biological effects of oxidants seem to be substantially determined by their impact on protein phosphorylation.

Oxidativer Stress bezeichnet die unkontrollierte langandauernde Produktion und Freisetzung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies. Zudem ist oxidativer Stress an der Entstehung und Progression einer Vielzahl von Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, Entzündung und Herz-Kreislauferkrankungen, maßgeblich beteiligt. Klinische Studien, in denen die systemische Therapie mit Antioxidanzien untersucht wurde, zeigten keinen Behandlungserfolg bei Patienten, sondern verschlechterten im Gegenteil die Symptome. Dieser Befund unterstützt die allgemeine Auffassung, dass endogen produzierte Oxidanzien wichtige Signalmoleküle darstellen, die durch gezielte oxidative posttranslationale Modifikation von Zielproteinen an der zellulären Signaltransduktion beteiligt und damit für die Aufrechterhaltung physiologischer Prozesse unverzichtbar sind. Die Wirkungen von Oxidanzien können sogar therapeutisch genutzt werden. So bewirkt beispielsweise die Behandlung mit der Säure des reduzierten Stickstoffmonoxids, die als Nitroxyl (HNO) bezeichnet wird, eine positiv inotrope und vasorelaxierende Wirkung, die gegenwärtig klinisch in Patienten mit akuter dekompensierter Herzinsuffizienz untersucht wird. Dabei ist jedoch ungeklärt, wie diese pro-oxidativ wirkenden HNO-Donatoren in Kardiomyozyten ihren positiv inotropen Effekt ausüben, der üblicherweise über Änderungen in der Phosphorylierung von Proteinen vermittelt wird, die an der elektromechanischen Kopplung beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit liefern eine umfassende Charakterisierung der molekularen Wirkmechanismen, die die positiv inotrope Wirkung experimenteller (1 Nitrosocyclohexylacetat; NCA) und klinischer (CXL-1020) HNO-Donatoren zu erklären versucht. Interessanterweise zeigten Experimente, die in adulten linksventrikulären Ratten-kardiomyozyten durchgeführt wurden, eine vermehrte HNO-vermittelte Phosphorylierung von Proteinen, die an der elektromechanischen Kopplung beteiligt sind. Mittels Förster-Resonanz-Energie-Transfer-Technologie, nicht-reduzierender Gelelektrophorese und subzellulärer Fraktionierung konnte die erhöhte Phosphorylierung auf die oxidative Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase zurückgeführt werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die HNO-Freisetzung durch CXL-1020 zu einer oxidativen Inhibition der Proteinphosphatase 2A führt, was somit einen Beitrag zu der erhöhten Phosphorylierung leisten könnte. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit erlauben die Schlussfolgerung, dass etablierte HNO-Donatoren signifikante Unterschiede in ihren molekularen Wirkmechanismen aufweisen, was eine individuelle Charakterisierung vor der klinischen Applikation dringend erforderlich macht. Im Einklang mit Daten, die in humanem Herzgewebe erhoben wurden, unterstützen diese Resultate die allgemeine Auffassung, dass der Phosphorylierungszustand an der Kontraktion beteiligter Proteine direkt und zuverlässig mit Änderungen in der kontraktilen Antwort korreliert. Die Wirkung von Oxidanzien scheint demnach wesentlich durch die verschiedenartigen Einflüsse auf die Proteinphosphorylierung bestimmt zu sein.