Identification and Characterization of Pathogenicity Determinants of H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Viruses isolated from the 2015 Poultry Outbreak in Ghana

Abstract

In Ghana, morbidity and mortality due to influenza was considered negligible until the 2009 H1N1 pandemic and the recent H5N1 highly pathogenic avian influenza A virus (HPAIV) outbreak in poultry. The country subsequently initiated an influenza surveillance programme for the general human population. However, a surveillance programme at the animal-human interface assessing the zoonotic potential of circulating avian influenza viruses is still missing. In this study, we aimed to identify and characterize circulating IAV strains in Ghana regarding their zoonotic potential. Therefore, we performed a sero-surveillance study among farmers and animals. We found that farmers were sero-positive against 2009 pandemic H1N1 and H3N2 IAV but not against H5N1 HPAIV. Poultry and pigs assessed at the respective farms were all sero-negative for the analyzed human strains suggesting that no transmission occured from human-to-animal. However, only a few months later, the H5N1 HPAIV poultry outbreak occurred in Ghana in 2015 resulting in significant economic losses. The outbreak was finally contained by stamping out over 100,000 poultry that put the country´s food security at risk. To analyze whether the H5N1 HPAIV strains might have acquired adaptive mutations in their genome possessing the potential to jump species barriers and infect humans, we have isolated these outbreak strains from several affected sites in Ghana. Phylogenetic analysis of the Ghanaian H5N1 HPAIV revealed that they harbor the polymerase subunit PB2 of H9N2 avian influenza viruses leading to their classification as the WHO clade 2.3.2.1c with known potential for human transmission. Interestingly, all isolated Ghanaian strains were closely related to H5N1 HPAIV 2015 outbreak strain from Nigeria with 80-99% amino acid homology. These findings suggested that the 2015 HPAIV strains in Ghana were likely introduced from Nigeria, where a similar outbreak was reported a few months earlier, probably by poultry movement between the countries. We then continued to analyze the Ghanaian H5N1 outbreak strains (isolated from Accra, Ketu and Obuasi) regarding their pandemic potential by assessing known molecular parameters of cross species transmission in vitro and in vivo. The viral receptor binding protein HA showed specificity to binding of avian-type α2,3-linked sialic acid containing receptors suggesting that they have not acquired the ability to bind to the human-type α2,6-linked sialic acid containing receptors yet. However, particularly the Accra H5N1 isolate presented high viral polymerase activity in human cells compared to an avian H5N1 outbreak strain isolated from birds in Germany (R65). In line, the H5N1 Accra isolate also displayed an increased replicative fitness in human cells, where they replicated to higher titers than the avian-type R65 but still lower than a human H5N1 isolate obtained from a fatal case in Thailand (KAN-1). Finally, all Ghanaian strains were pathogenic in mice without prior adaptation. The Obuasi strain showed highest pathogenicity with 100% lethality in mice similar to KAN-1, while the Ketu and Accra strains showed 40-50% lethality. In summary, our findings suggest that the 2015 Ghanaian outbreak strains have already acquired human-adaptive signatures, which highlights their potential for zoonotic transmission from animal-to-man. Future studies are required to identify specific mutations in the viral genome that mediate elevated polymerase activity and replicative fitness in human cells. This information will be invaluable to establish and improve influenza surveillance systems at the animal-human interface not only in Ghana but worldwide.

Die Influenza bedingte Morbidität und Mortalität wurde lange Zeit in Ghana vernachlässigt. Erst im Nachgang der H1N1 Pandemie in 2009 sowie nach wiederholten Geflügelpest Ausbrüchen im Land wurden Surveillance Programme gegen humane Influenza initiiert. Ein entsprechendes Programm gegen aviäre Influenza mit dem Ziel das zoonotische Potenzial neuartiger Influenzaviren aus dem Tierreich zu untersuchen ist bis heute nicht existent. Ziel dieser Arbeit war es, das zoonotische Potenzial von zirkulierenden Influenza A Viren (IAV) in Ghana mittels molekularbiologischer Methoden sowie im Mausmodell zu untersuchen. Dazu wurde zunächst eine Seroprevalenzstudie in Tiermärkten durchgeführt. Die dort arbeitenden Tierhändler waren alle sero-positiv gegen humane 2009 pandemische H1N1 und H3N2 jedoch nicht gegen aviäre H5N1 IAV. Alle untersuchten Tiere in diesen Geflügelmärkten, wie z.B. Geflügel und Schweine waren sero-negativ für die getesteten IAV Subtypen. Diese Daten sprechen dafür, dass in dem untersuchten Tiermarkt keine unmittlebare Tier-zu-Mensch Transmission von IAV stattgefunden hat. Wenige Monate später jedoch wurde über einen H5N1 Geflügelpest Ausbruch auf anderen Tiermärkten berichtet. Dieser Ausbruch unter domestiziertem Geflügel führte zur Keulung von über 100.000 betroffenem Geflügel, das in einem kleinen Land wie Ghana, eine maßgebliche Bedrohung der Nahrungsversorgung bedeutet. Daraufhin wurden im Rahmen dieser Arbeit hochpathogene aviäre Influenza A Viren (HPAIV) des H5N1 Subtyps von infiziertem Geflügel aus den betroffenen Tiermärkten aus insgesamt drei verschiedenen Regionen in Ghana (Accra, Ketu und Obuassi) isoliert und hinsichtlich ihres zoonotischen Potenzials molekularbiologisch und pathologisch untersucht. Die Sequenzanalysen sowie die phylogenetischen Berechnungen der Ghanaischen H5N1 HPAIV zeigten eine hohe Homologie mit 80-99% zu den H5N1 HPAIV Isolaten aus Nigeria, die dort kurz vorher zu einem Ausbruch in betroffenen Tieren führten. Diese neuartigen H5N1 Stämme aus Ghana wurden dem clade 2.3.2.1c zugeordnet, welche nach der Weltgesundheitsorganisation ein hohes zoonotisches Potenzial besitzen. Unsere phylogenetischen Daten sprechen dafür, dass das H5N1 HPAIV wahrscheinlich über den Tierhandel aus Nigeria nach Ghana eingeführt wurde. Weitere molekularbiologische Analysen zeigten, dass alle drei H5N1 HPAIV aus Ghana eine Spezifität gegen aviär-typische Rezeptoren (α2,3-glykodisch gebundene Sialinsäuren) besitzen. Somit scheint noch keine Anpassung des viralen Rezeptor-bindenden Proteins, dem Hämagglutinin, an die human-typischen Rezeptoren (α2,6-glykodisch gebundene Sialinsäuren) stattgefunden zu haben. Untersuchungen zu adaptiven Eigenschaften der viralen Polymerase in humanen Zellen zeigten, dass vor allem das H5N1 HPAIV aus Accra im Vergleich zu einem aviären H5N1 Isolat aus Deutschland (R65) eine erhöhte Polymeraseaktivität besitzt. Diese Aktivität der Accra Polymerase war jedoch niedriger als die eines humanen H5N1 Isolats aus Thailand (KAN-1). Diese Daten sprechen dafür, dass die H5N1 Polymerase des Accra Isolats bereits teilweise human-adaptive Signaturen erworben hat. Weitere Replikationskinetiken im gesamten Viruskontext in humanen Zellen konnten die erhöhte replikative Fitness des H5N1 Accra Isolats im Vergleich zum H5N1 aviären R65 jedoch nicht zum humanen KAN-1 Isolat bestätigen. Auch diese Daten sprechen für einen intermediären Adaptationsphänotypen des H5N1 HPAIV aus Accra. Desweiteren zeigten Pathogeneseuntersuchungen in der Maus, dass alle drei getesteten H5N1 HPAIV aus Ghana ohne vorherige Adaptation einen Gewichtsverlust sowie eine Letalität varrierend zwischen 40-100% verursachen können. Allerdings sind die in diesem Tierversuch verwendete Anzahl der Mäuse klein und eine Bestätigung mit einer größeren Tiergruppe ist erforderlich, um signifikante Aussagen über die Virulenz der einzelnen H5N1 Isolate aus Ghana treffen zu können. Auch sind weitere Untersuchungen notwendig, weitere adaptive Mutationen im Virusgenom zu identifizieren, die zu einer hohen Polymeraseaktivität sowie replikativen Fitness in humanen Zellen führen. Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Untersuchungen erste Hinweise darüber liefern, dass die in Ghana zirkulierenden aviären IAV bereits human-adaptive Eigenschaften zeigen. Diese Befunde sprechen auch dafür, dass in Afrika ein Surveillance Programm gegen zoonotische Influenza an der Grenze zwischen Tier und Mensch dringend notwendig ist. Erst dadurch kann rechtzeitig das pandemische Potenzial dieser neuartigen HPAIV bestimmt werden, um gegebenenfalls Gegenmaßnahmen rechtzeitig einzuleiten.