| Zusammenfassung: | Das von Vibrio cholerae produzierte Choleratoxin ist der Auslöser der schweren Durchfallerkrankung Cholera, an welcher jährlich mehrere Millionen Menschen erkranken. Das Shiga-like Toxin 1, Shigatoxin 1 oder Verotoxin 1 wird von Shigatoxin-bildenden Escherichia coli produziert, welche unter anderem das hämolytisch-urämische Syndrom auslösen können. Beide Toxine sind aus einer monomeren A-Untereinh... Das von Vibrio cholerae produzierte Choleratoxin ist der Auslöser der schweren Durchfallerkrankung Cholera, an welcher jährlich mehrere Millionen Menschen erkranken. Das Shiga-like Toxin 1, Shigatoxin 1 oder Verotoxin 1 wird von Shigatoxin-bildenden Escherichia coli produziert, welche unter anderem das hämolytisch-urämische Syndrom auslösen können. Beide Toxine sind aus einer monomeren A-Untereinheit und fünf ein Pentamer bildenden B-Untereinheiten aufgebaute AB5-Toxine.
In der vorliegenden Arbeit wurden Aptamere, kurze einzelsträngige Nukleinsäuren, die durch ihre Faltung spezifisch an Zielmoleküle binden können und daher in der Analytik als Antikörperalternativen eingesetzt werden, mittels Just in Time-Selection gegen das B-Pentamer des heterolog exprimierten Choleratoxins (CT-B) und Shigatoxins 1 (ST1-B) selektiert und charakterisiert.
Das sehr affine und selektive Choleratoxin-Aptamer CT916 (KD = 48,5 nM bzw. 66,1 nM) wurde in Kombination mit Antikörpern zur Entwicklung eines Magnetpartikel-basierten Sandwich Enzyme-linked Aptamer Assays eingesetzt, mit welchem Choleratoxin mit einer Nachweisgrenze von 2,1 ng/ml bzw. 2,4 ng/ml in dotiertem Puffer bzw. dotiertem Leitungswasser nachgewiesen werden konnte. Weiterhin wurden vier verschiedene Lateral Flow Assays entwickelt; (i) ein auf Kompetition mit immobilisiertem CT-B beruhender kompetitiver Assay mit Detektor-Aptamer und einer Nachweisgrenze von 51 ng/ml, (ii) ein einfaches Sandwich mit einem Fänger-Antikörper und Detektor-Aptamer mit einer Nachweisgrenze von 5 ng/ml, (iii) ein mobiles Sandwich mit zwei Fänger-Antikörpern und einem Detektor-Aptamer und einer Nachweisgrenze von 0,6 ng/ml, sowie (iv) ein Sandwich mit Fänger-Aptamer und GM1-Rezeptor-modifizierten Liposomen als Detektor mit einer Nachweisgrenze von 2 ng/ml in Puffer.
Das Shigatoxin 1-Aptamer ST1076 (KD = 14,7 nM) wurde zusammen mit den Shigatoxin 1-spezifischen Glykoproteinen des Taubeneiweißes zur Entwicklung eines Magnetpartikel-basierten Sandwich Enzyme-linked Aptamer Assays verwendet, mit dem Shigatoxin 1 in dotiertem Puffer, fettfreier und fettarmer Milch sowie Hackfleisch mit Nachweisgrenzen von 105,4 ng/ml, 270,8 ng/ml, 414,2 ng/ml und 269,6 ng/ml nachgewiesen werden konnte.
Zusätzlich wurden die Cholera- bzw. Shigatoxin 1-Aptamere CT916 und ST1065 (KD = 26,9 nM) in einer weiteren biotechnologischen Anwendung erfolgreich zur Affinitätsanreicherung von CT-B und ST1-B aus Zellpellets eingesetzt.
Zuletzt wurden Kleinwinkelröntgenstreuungsexperimente (small angle X-ray scattering) zur Aufklärung der Struktur des Aptamers CT916 und zur Untersuchung seiner Bindungsstelle an CT-B durchgeführt.
Cholera toxin produced by Vibrio cholerae is the causative agent of the eponymous severe diarrheal disease, which affects several million people every year. Shiga-like toxin 1, Shiga toxin 1 or Verotoxin 1 is secreted by Shiga toxin producing Escherichia coli, which can cause haemolytic uremic syndrome amongst others. Both are AB5 toxins composed of a monomeric A subunit and five pentamer-forming ... Cholera toxin produced by Vibrio cholerae is the causative agent of the eponymous severe diarrheal disease, which affects several million people every year. Shiga-like toxin 1, Shiga toxin 1 or Verotoxin 1 is secreted by Shiga toxin producing Escherichia coli, which can cause haemolytic uremic syndrome amongst others. Both are AB5 toxins composed of a monomeric A subunit and five pentamer-forming B subunits.
In the present study, aptamers, short single-stranded nucleic acids, which by their folding can specifically bind to target molecules and are therefore used in analytics as antibody alternatives, were selected by Just in Time-selection against the B pentamers of the heterologously expressed cholera toxin (CT-B) and Shiga toxin 1 (ST1-B) and thoroughly characterized.
The highly affine and selective cholera toxin aptamer CT916 (KD = 48.5 nM and 66.1 nM, respectively) was used in combination with antibodies to develop a magnetic bead-based sandwich enzyme-linked aptamer assay with a detection limit of 2.1 ng/ml and 2.4 ng/ml for cholera toxin detection in spiked buffer and tap water, respectively. Furthermore, four different lateral flow assays were developed; (i) a competitive assay with immobilized CT-B and a detector aptamer having a detection limit of 51 ng/ml, (ii) a simple sandwich with a capture antibody and detector aptamer having a detection limit of 5 ng/ml, (iii) a mobile sandwich with two capture antibodies and a detector aptamer having a detection limit of 0.6 ng/ml, as well as (iv) a sandwich with capture aptamer and GM1 receptor-modified liposomes as detector having a detection limit of 2 ng/ml in buffer.
The Shiga toxin 1 aptamer ST1076 (KD = 14.7 nM) was used in combination with Shiga toxin 1 specific pigeon egg white glycoproteins for the development of a magnetic bead-based sandwich enzyme-linked aptamer assay, which was capable of Shiga toxin 1 detection in spiked buffer, low and medium fat milk and ground beef at detection limits of 105.4 ng/ml, 270.8 ng/ml, 414.2 ng/ml and 269.6 ng/ml, respectively.
In addition, the cholera and Shiga toxin 1 aptamers CT916 and ST1065 (KD = 26.9 nM) were successfully used in another biotechnological application for the affinity enrichment of CT-B and ST1-B from cell pellets.
Finally, small-angle X-ray scattering experiments were performed to elucidate the structure of aptamer CT916 and study its binding site to CT-B. |
